蓝靛果蓝莓复合果酒抗氧化能力的研究

时间：2024-07-28

薛桂新

（延边大学农学院食品科学系，吉林延吉 133002）

发酵果酒作为一种健康酒类，开发的种类逐渐增多。随着研究的进行，人们逐渐认识到单一品种的果酒在色、香、味及营养成分和保健价值方面存在一定的不足和缺陷。复合发酵果酒综合了各种果汁的优势和特点，营养更加丰富，保健价值也更加合理，酿出的果酒色香味俱佳、风格独特[1]。近年来复合型果酒的研究成为热点，如黑莓山楂复合发酵果酒、金樱子火棘复合果酒、椰子水腰果梨复合果酒、草莓金樱子复合果酒[2-5]，柑橘梨汁复合酒、芒果木瓜复合酒、山楂葡萄复合酒、雪莲果西番莲复合酒、樱桃番茄复合酒、蓝莓葡萄复合酒和桑葚五味子复合发酵酒等[6-12]，但大都是加工工艺及生产技术等方面的研究。而集营养保健于一身的蓝靛果蓝莓复合果酒及其抗氧化能力的研究却很少，除了杨占江[13]专利外，其他少见报道。

本实验对不同蓝莓添加量的蓝靛果蓝莓复合果酒进行了研制，然后以自制的蓝靛果蓝莓复合果酒为研究对象，比较研究了复合果酒在陈酿期间抗氧化能力的高低及其变化趋势，为蓝靛果蓝莓复合果酒的开发利用提供理论依据，也为蓝靛果蓝莓复合果酒最佳饮用期的确定提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝靛果由延边林业科学研究院种植基地提供，蓝莓采自吉林省安图县蓝莓种植基地。六氰合铁酸钾、三氯乙酸、硫酸亚铁、抗坏血酸、邻苯三酚和苯酚、三氯化铁、三羟基氨基甲烷、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）：北京Solarbio公司；以上药品均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1102分光光度计：上海天美科学仪器有限公司；BSA124S-CW电子天平：赛多利斯科学仪器有限公司；PHS-3C型数字酸度计：上海鹏顺科学仪器有限公司；FJ-2000型高速分散均质机：上海标本模型厂；DW-86L828超低温冰箱：青岛海尔集团。

1.3 实验方法

1.3.1 蓝靛果蓝莓复合果酒的研制

蓝靛果、蓝莓采收后放在低温冰箱中冻结贮存。实验时将冻结的果实解冻后分选、破碎、果浆调整成分、发酵、过滤、后发酵、陈酿后，得到蓝靛果蓝莓复合果酒。

本实验以不添加蓝莓为对照，采用3种不同处理，每个处理蓝靛果和蓝莓总量为5 kg，每个处理蓝靛果和蓝莓复合比例不同，其中处理1、处理2、处理3蓝莓添加量分别为10%、30%、50%。

1.3.2 蓝靛果蓝莓复合果酒指标测定方法

酒精度：GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精计法；可溶性固形物：手持糖度计法；总酸：酸碱滴定法；总糖：采用苯酚硫酸法[14]；多酚：福林试剂法[15]。

1.3.3 蓝靛果蓝莓复合果酒抗氧化能力的实验方法

蓝靛果蓝莓复合果酒抗氧化作用选择了对DPPH自由基、超氧阴离子、羟自由基和还原力的测定四个指标进行研究。

（1）蓝靛果蓝莓复合果酒清除DPPH·的实验方法

称取0.012 8 g DPPH，用无水乙醇溶解于50 mL容量瓶，定容，摇匀，作为储备液保存于冰箱中，使用时用无水乙醇稀释10倍。吸取10 mL DPPH储备液，用无水乙醇定容于100 mL容量瓶中摇匀，30 min后在517 nm波长处测定吸光度值，按下列公式计算DPPH自由基清除率：

式中：SA为DPPH自由基的清除率，%；Ac为空白试剂的吸光度值；As为样品的吸光度值。

（2）蓝莓复合果酒清除超氧阴离子（O2-·）的实验方法

采用邻苯三酚自氧化法。取4.5 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液，加4.2 mL蒸馏水混匀后在25 ℃恒温水浴中保温20 min后，取出立即加入在25 ℃预热过的3 mmol/L邻苯三酚溶液0.3 mL（以l0 mmol/L HCl配制，空白用10 mmol/L HCl代替邻苯三酚HCl溶液），迅速摇匀后倒入比色杯，每隔0.5 min在320 nm处测定溶液的吸光度，计算线性范围内每分钟吸光度的增加值。

取4.5 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCI缓冲液，加入3.3 mL蒸馏水混匀后在25 ℃恒温水浴中保温20 min后，取出立即加入复合果酒0.9 mL，再加入在25 ℃预热过的3 mmol/L邻苯三酚溶液0.3 mL，迅速摇匀后倒入比色杯，每隔0.5 min在320 nm处测定溶液的吸光度值，计算线性范围内每分钟吸光度的增加值。

式中：△A0为一定时间内对照吸光度值的变化；△A为一定时间内样品吸光度值的变化。

（3）蓝靛果蓝莓复合果酒清除羟自由基（·OH）的实验方法

本实验采用水杨酸比色法。利用H2O2与Fe2+反应产生羟自由基，在体系内加入水杨酸捕捉并产生有色物质，该物质在510 nm下有最大吸收。反应体系中依次加入10 mmol/L FeSO41 mL，10 mmol/L水杨酸-乙醇1 mL，复合果酒1 mL，最后加8.8 mmol/L H2O21 mL启动反应，在37 ℃条件下反应0.5 h，以蒸馏水为对照，测定吸光度值。考虑复合果酒本身的颜色，以10 mmol/L FeSO41 mL，10 mmol/L水杨酸-乙醇1 mL，复合果酒1 mL，1 mL蒸馏水作为复合果酒的本底值。

式中：A0为对照的吸光度值；A1为样品反应体系的吸光度值；A2为复合果酒本底值的吸光度值。

1.3.4 蓝靛果蓝莓复合果酒还原力的实验方法

取复合果酒2.5 mL，加入25 mL 0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH=6.6）和2.5 mL 1%六氰合铁酸钾溶液[K3Fe（CN）6]，于50 ℃水浴保温20 min后快速冷却，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），离心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸馏水，0.5 mL 0.1%的三氯化铁溶液，充分混匀，静置10 min后，在700 nm处测定其吸光度值（以蒸馏水为对照），吸光度值的大小代表复合果酒还原力的高低。

2 结果与分析

2.1 蓝靛果蓝莓复合果酒的理化指标

表1 蓝靛果蓝莓复合果酒的理化指标Table 1 Physicochemical indexes of Lonicera edulis and blueberries compound wine

由表1可知，四种复合果酒中可溶性固形物、总糖和总酸含量差异很小；酒精度和多酚存在一定的差异，对照均高于处理。三个处理相比，酒精度处理1＞处理2和处理3，多酚含量处理1＞处理2＞处理3，即随着复合酒中蓝莓添加量的增多，多酚含量随之减少，这是因为蓝莓多酚含量显著低于蓝靛果（P＜0.01）[16]，所以蓝莓添加量越多，多酚含量就越少。

2.2 蓝靛果蓝莓复合果酒清除DPPH·能力的比较

由图1可知，蓝靛果蓝莓复合果酒中，蓝莓的添加量不同清除DPPH自由基的能力也不同。处理1和处理2清除DPPH自由基的能力好于对照（P＜0.05），处理3与对照相当，这表明蓝靛果蓝莓复合果酒具有清除DPPH自由基的能力，并且随着蓝莓添加量增多，清除DPPH自由基的能力反而减小，这是因为蓝莓中多酚、黄酮和花色苷含量显著低于蓝靛果（P＜0.01）[16]，这些成分具有较强的清除自由基能力和抗氧化活性[17]，所以蓝莓添加量增多，抗氧化活性成分减少，清除DPPH自由基的能力也随着降低。本实验中蓝莓添加量为10%的处理清除DPPH自由基的能力最强。从曲线的趋势看，随着陈酿时间的延长清除DPPH自由基的能力逐渐降低，陈酿5个月后蓝莓添加量为10%、30%、50%和对照清除DPPH自由基的能力分别降低了42.17%、48.66%、50.67%和51.53%。

图1 不同蓝莓添加量对复合酒DPPH自由基清除率的影响Fig.1 Effect of blueberry addition on scavenging activity of DPPH free radical of compound wine

2.3 蓝靛果蓝莓复合果酒清除超氧阴离子（O2-·）能力的比较

图2 不同蓝莓添加量对复合酒超氧阴离子清除率的影响Fig.2 Effect of blueberry addition on scavenging activity of superoxide anion of compound wine

由图2可知，蓝靛果蓝莓复合果酒中蓝莓的添加量不同清除超氧阴离子的能力也不同，处理1＞处理2＞处理3，处理1和处理2清除超氧阴离子的能力明显好于对照（P＜0.05），而处理3清除超氧阴离子的能力低于对照，这可能是因为蓝靛果蓝莓复合果酒的抗氧化能力不仅与总多酚、总黄酮和总原花青素等含量水平相关，还与其各自组分的含量相关，并且它们之间存在着增效或拮抗作用[18]。处理3蓝莓添加量为50%，在这个含量水平总多酚、总黄酮和总原花青素及其各自组分可能存在拮抗作用，所以其抗氧化能力低于对照，而处理1和处理2蓝莓添加量分别为10%和30%，在这个含量水平总多酚、总黄酮和总原花青素及其各自组分可能存在增效作用，所以其抗氧化能力高于对照。本实验中蓝莓添加量为10%的处理清除超氧阴离子的能力最强。从曲线的趋势看，随着陈酿时间的延长清除超氧阴离子的能力逐渐降低。陈酿5个月后蓝莓添加量为10%、30%、50%和对照清除超氧阴离子的能力分别降低了49.05%、59.43%、59.19%和58.62%。

2.4 蓝靛果蓝莓复合果酒清除羟自由基（·OH）能力的比较

图3 不同蓝莓添加量对复合酒羟自由基清除率的影响Fig.3 Effect of blueberry addition on scavenging activity of hydroxyl radical of compound wine

由图3可知，蓝靛果蓝莓复合果酒中蓝莓的添加量不同清除羟自由基的能力也不同。处理1＞处理2＞处理3，处理1、处理2清除羟自由基的能力明显强于对照（P＜0.05），而处理3清除羟自由基的能力低于对照，这一结果与图2清除超氧阴离子的结果一致，其原因也是因为蓝靛果蓝莓复合果酒的抗氧化能力与总多酚、总黄酮和总原花青素等含量、各自组分的含量以及它们之间存在着增效或拮抗作用有关。本实验中蓝莓添加量为10%的清除羟自由基的能力远远高于其他处理。从曲线的趋势看，随着陈酿时间的延长，蓝靛果蓝莓复合果酒清除羟自由基的能力逐渐降低。陈酿5个月后蓝莓添加量为10%、30%、50%和对照清除羟自由基的能力分别降低了47.63%、62.29%、83.50%和71.07%。

2.5 蓝靛果蓝莓复合果酒还原力的比较

图4 不同蓝莓添加量对复合酒还原力的影响Fig.4 Effect of blueberry addition on reducing power of compound wine

由图4可知，处理1的OD值明显大于对照（P＜0.05），处理2的OD值与对照几乎一致，处理3的OD值比对照低。以OD值的高低来衡量各个处理的还原力的大小，处理1还原力最好，处理2与对照基本一致，处理3低于对照。从曲线的趋势看，随着陈酿时间的延长，蓝靛果蓝莓复合果酒的还原力逐渐降低，可能是因为蓝靛果蓝莓复合果酒在陈酿期间存在着一定量的溶解氧，这些溶解氧与总多酚、总黄酮、总原花青素等活性成分发生反应，降低了活性物质的含量，也可能使活性成分的结构发生变化，导致抗氧化能力降低；而且蓝靛果蓝莓复合果酒是一种复杂的混合体系，陈酿期间发生多种生理生化变化和酶促反应，这些反应可能影响活性成分的抗氧化机理，也会导致抗氧化能力降低。陈酿5个月后蓝莓添加量为10%、30%、50%和对照的还原力分别降低了40.02%、41.29%、52.94%和38.70%。

3 结论

本实验选择的DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子及铁离子还原力是目前常用于评价天然抗氧化成分体外抗氧化活性高低的四种方法[19]。蓝靛果蓝莓复合果酒中蓝莓添加量不同表现出的抗氧化能力也不同，蓝莓添加量为10%和30%的复合果酒，其DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子的清除率均高于对照，而铁离子还原力则不同，只有添加10%蓝莓的复合酒明显高于对照。由此可见，由于各种评价方法的机理有所差异，同一物质在不同评价体系里可能表现出不同的抗氧化活性[20]。所以采用多种方法综合评价蓝靛果蓝莓复合果酒的抗氧化能力是很有必要的。

蓝莓添加量为10%的复合果酒其抗氧化能力最高，随着陈酿时间的延长，蓝靛果蓝莓复合果酒清除DPPH自由基、羟自由基、超氧阴离子的能力和铁离子还原力均很快下降，陈酿5个月后其抗氧化能力下降幅度可达40%以上。

不论是蓝靛果蓝莓复合果酒还是单一蓝靛果果酒，随着陈酿时间的延长，四种抗氧化评价指标均很快下降，尤其清除羟自由基的能力下降的幅度更大。从果酒风味的角度看，酒是陈的香，但从抗氧化的角度评价，果酒酿造后应尽快适量饮用更有利于身体健康。所以，从风味和保健两方面评价果酒比单从风味或保健一个方面评价果酒更科学更全面。

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