基于Biolog ECO技术分离窖泥细菌的研究

时间：2024-07-28

汤有宏，吴文睿

（安徽古井贡酒股份有限公司，安徽亳州 236820）

Biolog ECO技术是通过微生物对碳源的利用能力来表征微生物群落代谢多样性和功能多样性，即利用微生物对不同碳源代谢率的差异，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行新陈代谢过程中产生的氧化还原酶与显色物质发生反应而导致的颜色变化，与标准数据库进行比对，即可得出最终鉴定结果。该法最初应用于纯种微生物鉴定，1991年开始应用于土壤微生物群落的研究。

窖泥微生物的生长、繁殖是以窖池和酒醅为基础，进行复杂的物质能量代谢过程，而浓香型白酒的品质与窖池微生物的代谢有着重要联系，对于老窖泥中功能微生物的研究一直都是浓香型白酒的一个重要科目；窖泥中微生物的研究目前主要包括窖泥中微生物种群及其变化规律研究、窖泥中功能微生物的研究及应用，窖泥中微生物种群的分离和鉴定，以及微生物代谢模式的初步构建。我国也从20 世纪60 年代开始对浓香型大曲酒与窖泥微生物的关系进行了研究，发现老窖泥中富集有多种厌氧功能菌、嫌气性梭状芽孢杆菌；20世纪80年代以来，中科院成都生物所对泸州老窖进行了深入的研究，从浓香型酒老窖中分离出一株产甲烷杆菌，开发出甲烷细菌与己酸菌共酵的二元发酵技术；对从泸州老窖泥中分离的微生物种群进行了分离和鉴定的研究。目前不少科研机构、院校和白酒厂完成了窖泥微生物研究项目，对各厂的窖泥微生物中功能菌进行较深入研究，对指导生产和推动酿酒技术进步起了很重要作用。由于各酒厂所处地理位置、气候环境和微生物群系不同，其窖泥微生物不尽相同。系统性研究古井贡酒窖泥微生物中功能菌以及古井贡酒窖泥微生物中特色菌株十分必要。

通过摸拟窖池微生物的微生态环境、针对窖池微生物的生长特点，利用不同的培养基，运用现代生物技术对古井窖泥微生物进行分离、鉴定及功能性的研究，了解窖泥功能菌的菌种特性、生长条件、作用机理；研究该项目解决酿酒生产过程中窖泥老化、失去活性，提高人工窖泥质量；探索窖泥微生物在白酒发酵中的作用机理，寻找古井贡酒特色功能菌。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

窖泥：安徽古井贡酒股份有限公司50年老窖泥。

1.1.2 培养基（质量百分数计）

液体富集培养基：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、葡萄糖3%、氯化钠0.05%、硫酸铵0.09%、硫酸铁0.01%、硫酸镁0.03%、酒醅浸提液、碳酸钙2%，pH 7.0，在121 ℃条件下灭菌20 min。

分离培养基：蛋白胨1%、牛肉膏0.5%、葡萄糖3%、氯化钠0.05%、硫酸铵0.09%、硫酸铁0.01%、硫酸镁0.03%、GaCl20.5%、酒醅浸提液、琼脂2%，pH 7.0，在121 ℃条件下灭菌20 min。

酒醅浸提液分离培养基：酒醅浸提液、GaCl20.5%、琼脂2.0%、葡萄糖1.0%、pH 6.5～7.0，在121 ℃条件下灭菌15 min。

富集培养基：NaAc 0.5%、酵母膏0.15%、MgSO4·7H2O 0.02%、K2HPO40.04%、（NH4）2SO40.05%、CaCO31%，酒醅浸提液，乙醇2.0%（灭菌后使用前加入），自然pH；0.12 MPa高压蒸汽灭菌20 min。固体培养基加入2.0%的琼脂。

分离培养基：NaAc 0.5%、酵母膏0.15%、MgSO4·7H2O 0.02%、K2HPO40.04%、（NH4）2SO40.05%、GaCl20.5%，酒醅浸提液，乙醇2.0%（灭菌后使用前加入），自然pH；0.12 MPa高压蒸汽灭菌20 min。固体培养基加入2.0%的琼脂。

出窖糟浸提液分离培养基：酒醅浸提液、GaCl20.5%、琼脂2.0%、乙醇2.0%（灭菌后使用前加入），pH 6.5～7.0。

Biolog鉴定板与培养基：美国Biolog公司。

1.2 仪器与设备

Biolog微生物鉴定系统：美国Biolog公司；Forma 3100直热式二氧化碳培养箱，厌氧工作站，2.5 L、5 L厌氧发酵罐：美国Thermo Scientific公司；DMI3000显微镜、DMI6000显微镜：德国BLeica公司。

1.3 实验方法

窖泥中的微生物以细菌为主，通过摸拟窖池微生物的微生态环境、针对窖池微生物的生长特点，利用不同的培养基，运用现代生物技术对古井窖泥微生物进行分离。针对窖泥中的微生物特点从二方面对窖泥功能菌进行分离、纯化。

1.3.1 以糖为碳源的窖泥中的微生物的分离、鉴定

取10 g老窖泥85 ℃加热处理10 min，冷却后加入富集培养基培养35 ℃培养5～7 d，另取10 g不进行加热处理的老窖泥加入富集培养基35 ℃条件下培养5～7 d，分别选取产气泡好的富集培养液经适当稀释，在不同的分离培养基进行涂布，分别在二氧化碳含量0、5%、10%，温度30 ℃、35 ℃进行好氧培养及厌氧培养。

富集培养液在30 ℃存放1～2月后，取富集培养液经适当稀释，在不同的分离培养基进行涂布，分别在二氧化碳含量0、5%、10%，温度30 ℃、35 ℃进行好氧培养及厌氧培养。

挑选上述方法进行培养平板上的单个菌落，进行纯化培养，待鉴定。

筛选菌株经过特定培养基1～2次纯化培养，经Biolog微生物鉴定仪鉴定，确定窖泥微生物菌株。

1.3.2 以非淀粉糖为碳源的窖泥中的微生物的分离、鉴定

取10 g老窖泥85 ℃加热处理10 min，冷却后加入富集培养基培养30～35 ℃培养7 d，另取不进行加10 g热处理的老窖泥加入富集培养基35 ℃条件下培养5～7 d，分别选取产气泡好的富集培养液经适当稀释，在不同的分离培养基进行涂布，分别在二氧化碳含量0、5%、10%，温度30 ℃、35 ℃进行好氧培养及厌氧培养。

挑选上述方法进行培养平板上的单个菌落，进行纯化培养，待鉴定。

筛选菌株经过特定培养基1～2次纯化培养，经Biolog微生物鉴定仪鉴定，确定窖泥微生物菌株。

1.3.3 Biolog微生物鉴定仪鉴定

利用微生物对不同碳源进行呼吸代谢的差异，针对每一类的微生物筛选95种不同的碳源或其他生物和化学物质，配合四唑类显色物质固定于96孔鉴定板上（A1孔为阴性对照），鉴定板底物不仅包含71种碳源，还增加了23种化学物灵敏性，接种菌悬液后培养一定时间，通过检测微生物细胞利用不同碳源进行呼吸代谢过程产生的氧化还原物质与显色物质发生反应而导致颜色的变化（吸光度值表示）以及由于微生物生长造成和的浊度差异，生成特征指纹图谱与标准菌株图谱数据库进行比对，即可得出最终鉴定结果。Biolog微生物鉴定仪鉴定方法属于的生理生化等表型测定鉴定方法，表型鉴定和基因型鉴定属两个不同的方法，对应两种不同的分类学，两者应互为补充。基因决定蛋白，进而决定表型，表型鉴定更为经典，对实际的研究和生产更具有价值。

鉴定步骤为：用Biolog专用培养基将纯种扩大培养；按要求配制一定浊度（细胞浓度）的菌悬液；将菌悬液接种至微孔鉴定板（Microplate），培养一定时间；将培养后的鉴定板放入读数仪中读数，软件自动给出鉴定结果。

2 结果与分析

通过上述方法完成两类菌120多株菌的纯化分离，通过微生物鉴定仪鉴定后，已鉴定确定80多株菌株，具体如表1所示。

目前从分离的、已鉴定87株菌株，大部分属于芽孢杆菌属（Bacillus）、芽孢乳杆菌属（Lactobacillus）、类芽孢杆菌属（Paenibacillus）、诺卡氏菌属（Nocardia）、梭菌属（Clostridium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、链球菌属（Streptococcus）、葡萄球菌属（Staphylococcus）、假单胞菌属（Pseudomonas）。其中以芽孢杆菌Bacillus为绝对优势菌（21株），诺卡氏菌属Nocardia（8株）、其他杆菌（7株）、梭菌属Clostridium（7株）、芽孢乳杆菌属Lactobacillus（5株）、类芽孢杆菌属Paenibacillus（6株）、链球菌属Streptococcus（4株）、葡萄球菌属Staphylococcus（4株）、其他球菌（7株）、假单胞菌Pseudomonas（3株）、棒杆菌属Corynebacterium（3株）、双歧杆菌Bifidobacterium（3株）为次优势菌，其余各属菌株均在3株以下。

表1 古井贡酒窖泥中分离出的可培养细菌及特性Table 1 Characteristics of culturable bacteria which separated from Gujing pit mud

续表

这些微生物对白酒酿造的过程都起着重要的作用，是浓香型大曲酒酿造不可缺少的微生物。与国内的窖泥研究相比较，此次从窖泥中分离筛选的微生物与国内的研究者也有着相似和不同的地方。从查询资料情况看，用经典方法分离、鉴定得到的窖泥微生物的菌种数量较少，本项目分离、鉴定得到的窖泥微生物的菌种数量是目前比较系统、全面的。目前许多单位用分子鉴定法（16S rDNA）鉴定窖泥微生物，该方法快速、全面、准确，但不能得到单个纯的菌种，不便继续对菌种的生理生化特征进行研究。

对于研究结果的差异性，一方面可能和酿酒酒厂的地理环境、酿酒工艺有关，另一方面也可能和分离方法局限性有着有一定的关系。

3 结论

浓香型白酒的生产以泥窖窖池为基础，发酵过程是栖息在窖池糟醅、窖泥中的庞大微生物群落在糟醅固、液、气三相界面进行着复杂的物质能量代谢过程。窖泥中长期驯化的微生物种群及其代谢产物又不断地进入糟醅中，各种菌的不同代谢产物相互制约、相互协调、相互作用才能形成酒的独特风味。目前分离的窖泥微生物的菌种许多是浓香型白酒重要功能性微生物，如以短小芽孢杆菌、耐硼赖氨酸芽孢杆菌、栗褐芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌为主的芽孢杆菌类，这类菌与白酒风味物质的产生有很大的关系；如乳杆菌属、德氏乳杆菌乳酸亚种、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、柠檬明串珠菌、肠膜明串珠菌乳脂亚种、短双歧杆菌、最小双歧杆菌、大双歧杆菌都是益生菌；有的菌株产酸、产酶能力强如梭菌属，如乳杆菌属、植物乳杆菌、戊糖乳杆菌德氏乳杆菌乳酸、凝结芽袍杆菌、嗜热脂肪芽袍杆菌产L-乳酸能力强。有的菌株产酶能力强，如解淀粉芽孢杆产淀粉酶、蛋白酶和DNA酶，烟草节杆菌能够兼产淀粉酶和蛋白酶。地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和蜡状芽孢杆菌的一些菌株产淀粉酶的活性较高，苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌产蛋白酶，产气肠杆菌产甘油脱氢酶。

目前正在对已分离、鉴定的窖泥微生物菌种进行菌种生理生化特性、发酵作用机理研究，探索窖泥微生物在白酒发酵中的作用机理，寻找古井贡酒窖泥特色功能菌。

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