一种方便筷子细菌菌落总数检测方法研究

孙梦桐，臧艺平，缪璐欢，杜静芳，吕欣然，白凤翎*

（渤海大学 化学化工与食品安全学院，辽宁省食品安全重点实验室“食品贮藏加工及质量安全控制工程技术研究中心”辽宁省高校重大科技平台，辽宁 锦州 121013）

随着生活节奏的加快，一次性产品大量进入人们的日常生活，其中一次性方便筷子是餐饮业使用最普遍的产品[1]。由于生产厂家的参差不齐，方便筷子的微生物污染问题比较突出[2-5]。一般应用于餐具表面检测细菌数量的方法为传统的棉拭子法，表面微生物的检测方法与分离微生物的难易程度有关，同时还取决于表面的结构及微生物的种类和性质[6-7]。研究发现，棉拭子法非常适用于柔软、粗糙及污染严重的表面[8]。此外，应用于表面细菌数量的测定方法还有接触平板法、琼脂注射法、黏性薄膜法、喷雾枪法等[9-13]。这些方法主要是应用培养介质或载体方式获取表面微生物，经定量稀释后，应用标准培养基进行计数。MOSSEL D A等[14]在检测木质表面微生物时，研究发现黏性薄膜法比棉拭子法效果差。

本研究以一次性方便筷子为研究对象，针对其表面比较坚硬、光滑和形状不规则的特点，采用直接振荡法与传统棉拭子法进行分析比较，探讨一种更适合检验不规则形状餐具表面的细菌菌落总数的检验方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 标准菌株

埃希氏大肠杆菌（Escherichia coliCMCC44102）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimuniunsCMCC50115）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureusCMCC26003）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformisACCC11091）：渤海大学食品科学研究院保藏。

1.1.2 培养基

平板计数琼脂培养基和LB培养基：北京奥博星生物技术有限公司。方便筷子：锦州市大润发超市。

1.2 仪器与设备

LRH系列生化培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司；MLS-3030CH型立式高压蒸汽灭菌器：SANYO电机（广州）有限公司；IKA Vortex GENIUS3振荡器：德国IKA公司。

1.3 方法

将埃希氏大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和地衣芽孢杆菌接种于LB液体培养基，置于37 ℃培养20 h，用无菌0.85%生理盐水稀释至菌浓度约为106CFU/mL。将一次性方便筷子一分为二后，用手术刀平均切为3段，121 ℃灭菌15 min。将无菌筷子浸泡在约106CFU/mL 4种试验菌株的菌液中，浸泡30 min后无菌条件下晾干，备用。

1.3.1 棉拭子法

用无菌棉拭子擦拭菌液浸泡后方便筷子的表面，每节筷子用3支棉拭子，反复擦拭3次，擦拭后置于9 mL灭菌生理盐水中，在IKA Vortex GENIUS3振荡器以2 000 r/min分别振荡4 min、8 min、12 min和16 min，振荡液进行10倍梯度稀释，选择10-3、10-4和10-5三个稀释度，按GB 4789.2—2012《食品微生物学检验大肠埃希氏菌计数》进行细菌菌落总数测定[15]。

1.3.2 振荡法

将菌液浸泡后的方便筷子直接置于10 mL灭菌生理盐水中，在IKA Vortex GENIUS3振荡器以2 000 r/min分别振荡4 min、8 min、12 min和16 min，振荡液进行10倍梯度稀释，选择10-3、10-4和10-5三个稀释度，按GB 4789.2—2012进行细菌菌落总数测定[10]。

1.3.3 数据统计分析

采用SPSS19软件对实验数据进行方差分析。当P＜0.05时，表示差异显著，当P＞0.05时，表示差异不显著，所有实验重复3次。

2 结果与讨论

应用振荡法和棉拭子法测定单支方便筷子表面埃希氏大肠杆菌菌落总数如图1所示，由图1可以看出，振荡法的检测结果明显高于棉拭子法，在8 min时振荡法与棉拭子法比值为1.25，达到最高值。经统计学分析，在4 min、8 min、12 min和16 min两种方法具有显著差异（P=0.013＜0.05）。

图1 方便筷子表面埃希氏大肠杆菌菌落总数测定结果Fig.1 Results of APC of E.coli on convenient chopsticks surface

图2是伤寒沙门氏菌菌液浸泡后的单支方便筷子表面经振荡法和棉拭子法测定的细菌菌落总数结果，从图2可以得出，振荡法明显高于棉拭子法（P=0.022＜0.05）。从振荡法与棉拭子法两者的比值来看，在4 min时最高，到8 min时变化趋势变缓。

图2 方便筷子表面伤寒沙门氏菌菌落总数测定结果Fig.2 Results of APC of S.typhimuniuns on convenient chopsticks surface

对革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌和地衣芽孢杆菌而言，从图3和图4可以看出，从4 min起始至12 min结束，其振荡法和棉拭子法两者的比值呈现先抑后扬的走势。就振荡法与棉拭子法的检测结果对比而言，振荡法明显高于棉拭子法，P值分别为0.002和0.006，两者具有显著差异。

图3 方便筷子表面金黄色葡萄球菌菌落总数测定结果Fig.3 Results of APC of S.aureus on convenient chopsticks surface

图4 方便筷子表面地衣芽孢杆菌菌落总数测定结果Fig.4 Results of APC of B.licheniformi s on convenient chopsticks surface

表1 振荡法与棉拭子法数据的成对样本t 检验Table 1 Paired samples test of oscillametric method and cotton swab method data

综合4种供试菌株的两种检测方法的比值，振荡法明显高出传统棉拭子法。且在4 min时达到最大值，因此选择4 min为振荡时间。

3 结论

应用振荡法检测筷子细菌菌落总数，与传统的棉拭子法进行比较，振荡法检测4种细菌的测定结果平均高出棉拭子法20%以上，两者具有显著性差异。在4 min时振荡法能检测数量多的细菌，所以最佳振荡时间为4 min。

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[15]中华人民共和国卫生部.GB 4789.2—2010 食品微生物学检验菌落总数测定[S].北京：中国标准出版社，2010.