薏米纳豆发酵工艺及其营养成分分析

时间：2024-07-28

董岳峰，麻秀芳，李晓艳，张璐，李小进，郭晓莺

（1.山西省医药与生命科学研究院，山西太原 030006；2.武警山西总队医院，山西太原 030006）

纳豆（natto）[1]是一种日本豆类发酵食品，是以黄豆为主要原料，蒸煮之后接入纳豆芽孢杆菌发酵而成，富含钙、磷、钠、钾及各种维生素，营养价值极高，对骨质疏松、心脑血管病和肿瘤等均有一定的预防作用[2]。纳豆含有一种发酵食品特殊的氨味，不易被国人所接受[3]。本实验通过在发酵底物配方中增加含糖量较高的辅料薏米，提高碳氮比来降低游离氨的生成，改善纳豆口感[4]。薏米是药食皆佳的杂粮之一，富含蛋白质、碳水化合物、8种氨基酸、亚油酸、维生素、各种微量元素以及薏醇、甾醇等[5]。薏米的糖质含量比大豆高，在大豆中加入一定量的薏米后，使糖质总量增加，提高纳豆发酵配方中的碳氮比，改善纳豆口感，并对薏米纳豆的营养成分进行综合分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆、薏米：购于山西省美特好连锁超市；凝血酶、尿激酶标准品：中国药品生物制品检定所；纤维蛋白原、考马斯亮蓝G-250：美国Sigma公司；纳豆芽孢杆菌：本实验室保存。

1.2 仪器与设备

YXQ-LS全自动高压灭菌锅：上海博迅实业有限公司；HZ-9211K恒温振荡器：太仓市科教器材厂；SHP-80生化培养箱：上海森信实验仪器有限公司；HH-501数显恒温水浴锅：常州国华仪器制造有限公司；CJ-1S超净工作台：天津泰斯特仪器有限公司；835-50型氨基酸分析仪：日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 纳豆菌生长曲线测定[6]

取液体培养的纳豆芽孢杆菌，用牛肉膏蛋白胨液体培养基调整纳豆芽孢杆菌浓度为1.0×108个/mL，用无菌移液管准确量取10 mL接种于装有90 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基的250 mL三角瓶中，置于37 ℃摇床，150 r/min培养，每4 h取样，平板菌落计数法计数，以培养时间为横坐标，菌体浓度为纵坐标，绘制生长曲线。

1.3.2 尿激酶标准曲线测定

纳豆激酶的纤溶酶活性是通过与尿激酶的活力比较，得到的相当于尿激酶的活力单位。酶活力测定参照Astrup法[7]。

1.3.3 纳豆激酶活力测定

称取新鲜薏米纳豆5 g加入100 mL无菌去离子水中，充分振荡，纱布过滤。取滤液10 μL 点样于纤维蛋白平板，放置10 min，37 ℃保温18 h，考马斯亮蓝G-250[8]染色5 min，测定溶圈直径，根据标准曲线计算薏米纳豆激酶活力。

1.3.4 薏米纳豆发酵工艺路线

精选黄豆，室温条件下浸泡4 h，沥干备用；薏米室温条件下浸泡2 h，100 ℃糊化15 min，沥干，薏米黄豆按质量比1∶4混合均匀，121 ℃灭菌20 min，冷却至60 ℃左右时接种液体纳豆菌（菌体浓度1.0×108CFU/mL），37 ℃培养24 h，4 ℃后熟24 h。

1.3.5 单因素试验

选取薏米黄豆质量比2∶8，接种量5%，发酵时间为24 h为基数，分别改变三个因素（薏米黄豆质量比、接种量、发酵时间）中的一个，进行单因素试验。其中薏米黄豆质量比1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5；接种量为3%、4%、5%、6%、7%；发酵时间为12 h、18 h、24 h、30 h、36 h。按照1.3.4的步骤进行操作，每组试验3个平行（n=3），分别进行感官评价，并测定纳豆菌总数和纳豆激酶酶活。

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1.3.6 薏米纳豆发酵工艺正交优化

在单因素试验的基础上，以薏米与黄豆质量比、接种量和发酵时间为主要因素，以感官评价分值、纳豆菌总数和纳豆激酶酶活性及三者的加权评分为评价指标，采用L9（34）正交表选取不同水平进行正交优化。感官评价采用双盲法打分，以表1评分标准进行打分[9]。

综合评分=（感官评价分值/感官评价最大分值）×100×0.4+（纳豆菌总数/纳豆菌总数最大值）×100×0.3+（纳豆激酶活力/纳豆激酶活力最大值）×100×0.3。

表1 薏米纳豆感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standard of coixseed-natto

1.3.7 相关指标测定

氨基酸成分测定：参考GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定方法》[10]；氨基酸态氮测定：采用甲醛滴定法[11]；总黄酮和多糖含量测定：参照《保健食品功效成分检测方法》，总黄酮测定采用分光光度法，多糖含量测定采用硫酸蒽酮法[12]；薏米纳豆水分测定参照GB/T 5009.3—2010《食品中水分的测定》采用干燥法测定[13]；总砷测定参照GB/T 5009.11—2003《食品中总砷及无机砷的测定》[14]；铅测定参照GB/T 5009.12—2010《食品中铅的测定》[15]；黄曲霉素B1参照GB/T 5009.22—2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定》检测[16]；粪大肠菌群参照GB 4789.39—2013《食品微生物学检验-粪大肠菌群计数》[17]检测，致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌）参照GB 4789.31—2013《食品微生物学检验-沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验》进行检验[18]。

1.3.8 氨基酸态氮测定

采用甲醛滴定法[11]。

参照《保健食品功效成分检测方法》，总黄酮测定采用分光光度法，多糖含量测定采用硫酸-蒽酮法[12]。

1.3.10 薏米纳豆理化指标和卫生学指标检测

薏米纳豆水分测定参照GB/T 5009.3—2010《食品中水分的测定》中干燥法测定[13]；总砷测定参照GB/T 5009.11—2003《食品中总砷及无机砷的测定》[14]；铅测定参照GB/T 5009.12—2010《食品中铅的测定》[15]；黄曲霉素B1参照GB/T 5009.22—2003《食品中黄曲霉毒素B1的测定》检测[16]；粪大肠菌群参照GB 4789.39—2013《食品微生物学检验-粪大肠菌群计数》[17]检测；致病菌（沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌）参照GB 4789.31—2013《食品微生物学检验-沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验》进行检验[18]。

2 结果与分析

2.1 纳豆菌生长曲线测定结果

图1 纳豆芽孢杆菌生长曲线Fig.1 Growth curve of Bacillus natto

液体培养的纳豆芽孢杆菌生长曲线见图1。由图1可知，在0～8 h内，纳豆芽孢杆菌生长速度较慢，处于延滞期；从8 h开始纳豆芽孢杆菌生长迅速，进入对数生长期；从20 h开始纳豆芽孢杆菌生长变缓，纳豆芽孢杆菌数趋于稳定，进入稳定期；从36 h开始纳豆芽孢杆菌数量开始减少，进入衰亡期。因此，作为固体培养的种子液选用培养16 h的纳豆芽孢杆菌。

2.2 尿激酶标准曲线测定结果

尿激酶活力标准曲线见图2，回归方程为y=0.039 1x+0.066 1，R2=0.999 5。

图2 尿激酶活力标准曲线Fig.2 Standard curve of urokinase activity

2.3 单因素试验结果

单因素试验结果见表2～表4。薏米黄豆质量比，接种量和发酵时间对薏米纳豆的感官评价、纳豆菌总数和纳豆激酶酶活力都有影响，各因素比较适宜的范围为薏米黄豆质量比为1∶9～3∶7，接种量为4%～6%，发酵时间为18～30 h。

表2 薏米黄豆质量比对试验结果的影响Table 2 Effect of coixseed and soybean ratio on coixseed-natto quality

表3 接种量对试验结果的影响Table 3 Effect of inoculum on coixseed-natto quality

表4 发酵时间对试验结果的影响Table 4 Effect of fermentation time on coixseed-natto quality

2.4 薏米纳豆发酵工艺正交优化结果与分析

由表5直观分析可知，薏米/黄豆质量比、接种量、发酵时间3个因素对综合评分的影响顺序为薏米/黄豆质量比＞接种量＞发酵时间，最优组合为A2B2C2。即薏米纳豆的最佳发酵工艺为薏米黄豆质量比2∶8，接种量5%，发酵时间为24 h。采用此工艺进行验证性试验（n=3），薏米纳豆的感官评价分值为96.78±0.45，纳豆菌总数（4.11±0.22）×108CFU/g，纳豆激酶活力（1 423±35）IU/g。由表6方差分析可知，薏米/黄豆质量比对综合评分的影响具有显著性（P＜0.05），接种量和发酵时间对试验结果影响无显著性（P＞0.05）。

表5 薏米纳豆发酵工艺正交试验设计及结果Table 5 Design and result of orthogonal experiment for fermentation technology optimization

表6 正交试验结果方差分析Table 6 Variance analysis of orthogonal experiments results

2.5 薏米纳豆氨基酸分析结果

薏米纳豆中氨基酸种类丰富，结果见表7。其中，8种必需氨基酸中除色氨酸外均被检测到，亮氨酸含量最高，为1.16%，赖氨酸和苏氨酸含量较低，均为0.62%，必需氨基酸总量为4.81%。非必需氨基酸中谷氨酸含量最高，为3.31%，其次为天冬氨酸，胱氨酸含量最低，为0.27%，非必需氨基酸总量为9.43%，薏米纳豆中的氨基酸总量为14.24%。

表7 薏米纳豆的氨基酸组成Table 7 Amino acids compositions of coixseed-natto

2.6 薏米纳豆总黄酮、多糖和氨基酸态氮分析

黄酮类化合物具有较强的抗氧化活性，可有效清除体内自由基，阻止细胞的退化、衰老以及癌症的发生[19]，薏米纳豆总黄酮含量为0.043%。多糖类化合物能发挥免疫调节作用，具有抗病毒和抗肿瘤活性[20]，薏米纳豆多糖含量为3.3%。氨基酸态氮是指以氨基酸形式存在的氮元素的含量，含量越高营养越好，薏米纳豆的含量为0.4%。

2.7 薏米纳豆理化指标和卫生学指标检测

表8 薏米纳豆理化指标和卫生学指标检测结果Table 8 Physicochemical properties and microbial index of coixseed-natto

3 结论

薏米纳豆的最佳发酵工艺为薏米黄豆质量比2∶8，接种量5%，发酵时间为24 h。薏米纳豆氨基酸含量为14.24%，种类丰富，富含黄酮、多糖、氨基酸态氮等活性成分，理化指标及卫生指标满足国家相关标准。产品气味芳香，黏液较多，氨基酸成分丰富，感官品质良好，口感良好，适合我国人民的饮食习惯。薏米的糖质含量比大豆高，在纳豆菌发酵纳豆的过程中，薏米的糖质与大豆中较高的蛋白质转化为纳豆中碳水化合物，从而减少纳豆游离氨的形成改善纳豆口感。此外，薏米纳豆的开发为大豆和薏米的深加工及附加值的提高开辟了新途径，对我国纳豆产业的发展及国民健康发挥重要作用。

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