响应面法优化黑木耳乳酸发酵工艺

许 月，朱 丹，魏文毅，牛广财 *，陈 璐，谭 慧

（1.黑龙江八一农垦大学 食品学院，黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院，黑龙江 大庆 163319）

黑木耳在我国具有多年的栽培历史，主产区在吉林、黑龙江、湖北等地，规模大、产量高、质量好。据不完全统计，我国出产的黑木耳品质和产量均居世界首位，年产量已达到100多万t。全世界超过90%的黑木耳产自中国，我国生产的黑木耳除少部分出口外，绝大多数为国内消费。由于黑木耳是一种食药兼用菌，营养价值高，且有很好的保健效果，被称为“素中之荤”[1]。目前，我国黑木耳加工业还处于发展的初级阶段，黑木耳加工产品的市场占有额不足整个销售市场的5%[2]。近年来，人们对黑木耳含量较高的有效成分，如多糖、膳食纤维、黑色素、多酚等进行了较深入的研究[3-8]。同时，研制的黑木耳深加工制品种类也比较丰富，一类是非发酵制品，如黑木耳纸状风味休闲食品、黑木耳脆片、黑木耳软糖、黑木耳饼干、黑木耳果酱果冻、黑木耳冰淇淋、黑木耳核桃复合乳饮料等[9-17]；另一类是发酵类制品，如黑木耳发酵饮料、黑木耳酸奶等[18-21]。

随着人们对保健食品的追求，发酵类制品越来越受到关注。目前，黑木耳乳酸发酵饮料、黑木耳豆奶的直投式乳酸菌发酵饮料等产品的研究开发较多[22-24]。但是，在黑木耳乳酸发酵制品的开发中，绝大多数是以保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌为菌种，而且必须添加奶源，这一定程度上限制了黑木耳发酵制品的种类和产品风味。本试验拟选用植物乳杆菌和短乳杆菌作为发酵剂，无需添加奶源，采用响应面法对黑木耳乳酸发酵的工艺参数进行研究，以期为黑木耳乳酸发酵的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑木耳：黑龙江省大庆市批发市场；植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）1.557、短乳杆菌（Lactobacillus brevis）1.12：黑龙江省科学院应用微生物研究所；果胶酶（4×105U/g）：上海致化化学科技开发有限公司；纤维素酶（5×104U/g）：北京奥博星生物技术有限责任公司；木瓜蛋白酶（1.2×106U/g）：河北天旭实业有限责任公司；MRS肉汤培养基：青岛海博生物公司；白砂糖（食品级）、氢氧化钠、邻苯二甲酸氢钾均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

BCN-1360超级洁净工作台：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；THZ-82A水浴恒温振荡器：金坛市华城开元实验仪器厂；LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；DRP-9082型电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司；L420台式低速自动平衡离心机：长沙湘仪离心机仪器有限公司；JJ-2型组织捣碎匀浆机：江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.3 方法

1.3.1 测定指标

总酸测定：GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》中的酸碱滴定法[25]。

1.3.2 黑木耳乳酸发酵工艺路线

1.3.3 操作要点

黑木耳干品在常温水中浸泡2～3 h，泡发好的黑木耳与纯净水按质量比1∶6的比例混合打碎，加入质量分数为2.4%的混合酶（果胶酶/纤维素酶/木瓜蛋白酶=1∶1∶8），在55 ℃条件下恒温振荡4 h得到黑木耳酶解液。在黑木耳酶解液中加入适量白砂糖，经高压灭菌后接入乳酸菌，在适宜条件下培养，即完成黑木耳的乳酸发酵。

1.3.4 菌种的选择

黑木耳酶解液中加入10%白砂糖，经灭菌后，分别接入植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，LP）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis，LB），植物乳杆菌与短乳杆菌按1∶1、1∶2、2∶1、3∶1、4∶1、1∶3、1∶4比例的混合菌，接种量为6%，在36 ℃条件下培养，一定时间后测其总酸含量。

1.3.5 单因素试验

（1）发酵时间对黑木耳产酸量的影响

黑木耳酶解液中加入10%白砂糖，经灭菌后接入混合菌6%，在38 ℃条件下分别培养24 h、48 h、60 h、72 h、84 h，测其总酸含量。

（2）发酵温度对黑木耳产酸量的影响

黑木耳酶解液中加入10%白砂糖，经灭菌后接入混合菌6%，分别在32 ℃、34 ℃、36 ℃、38 ℃、40 ℃条件下培养72 h，测其总酸含量。

（3）接种量对黑木耳产酸量的影响

黑木耳酶解液中加入10%白砂糖，经灭菌后，分别接入3%、4%、5%、6%、7%混合菌，在38 ℃条件下培养72 h，测其总酸含量。

（4）加糖量对黑木耳产酸量的影响

黑木耳酶解液中分别加入5%、6%、7%、8%、9%、10%白砂糖，经灭菌后，接入混合菌6%，在38 ℃条件下培养72 h，测其总酸含量。

1.3.6 响应面法优化发酵工艺

在单因素试验基础上，根据Box-Benhnken 中心组合试验设计原理，以总酸（Y）为响应值，设计4因素3水平响应面分析试验，因素水平编码见表1。数据用Design 8.0.6.1程序分析。

表1 Box-Benhnken试验因素水平及编码Table 1 Factors and coded levels of Box-Benhnken design

2 结果与分析

2.1 菌种的选择

如图1所示，菌种编号1～9分别为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，LP）单一菌、短乳杆菌（Lactobacillus brevis，LB）单一菌、植物乳杆菌（LP）与短乳杆菌（LB）按1∶1、1∶2、2∶1、3∶1、4∶1、1∶3、1∶4的比例混合菌。在培养24 h、48 h、60 h、72 h时分别测其总酸的含量。结果表明，在发酵48 h时，产酸增速最大。植物乳杆菌与短乳杆菌以2∶1比例混合菌在各时段产酸情况均较好，优于其他比例混合菌。这是因为混合菌种共同生长会产生协同发酵作用，植物乳杆菌发酵形成的良好环境，也促进了短乳杆菌的快速生长；同时，短乳杆菌的生长代谢也会促进植物乳杆菌的增殖，两者的混合菌种能在较短的时间迅速产生乳酸，提高了黑木耳酶解发酵基质的产酸量。故菌种选为植物乳杆菌与短乳杆菌以2∶1比例混合菌。

图1 不同菌种在不同发酵时间下对总酸含量的影响Fig.1 Effects of different strains on total acid content at different fermentation time

2.2 单因素试验结果

2.2.1 发酵时间对黑木耳产酸情况的影响

由图2可知，48～72 h的发酵过程中，产酸较缓慢，总酸含量呈缓慢上升趋势。当发酵至84 h时，增速最快，产酸含量最高达到10.18 g/L。在发酵至96 h时，总酸含量变化不大，趋于平稳，可见发酵已接近尾声。由此，选择发酵时间范围60～84 h进行后续研究。

图2 发酵时间对黑木耳产酸情况的影响Fig.2 Effects of fermentation time on acid production of black fungus

2.2.2 发酵温度对黑木耳产酸情况的影响

由图3可知，32 ℃时发酵速度较慢，产酸较低。34～38 ℃时，随着温度的升高，发酵逐步剧烈，产酸速度逐步提升，38 ℃时达到最高点，达到7.23 g/L。当温度在38 ℃以后时，总酸含量没有继续升高反而开始下降，这与温度较高，超过菌种最适宜的发酵温度有关。综合考虑总酸含量，选择发酵温度范围36～40 ℃进一步优化。

图3 发酵温度对黑木耳产酸情况的影响Fig.3 Effects of fermentation temperature on acid production of black fungus

2.2.3 接种量对黑木耳产酸情况的影响

由图4可知，接种量为3%时，产酸水平最低，为7.54 g/L。接种量为4%时，总酸含量最高，达到8.52 g/L。之后随着接种量不断增加，在接种量为5%～7%范围时，总酸含量呈下降趋势。这说明接种量过多或者过少，均不利于乳酸菌的繁殖和产酸。接种量过低时，由于其基数少，菌的数量增加相对缓慢；接种量过高时，由于较高酸度又会抑制乳酸菌的继续繁殖与生长。所以，选择3%～7%的接种量范围进行后续优化试验。

图4 接种量对黑木耳产酸情况的影响Fig.4 Effect of inoculum on acid production of black fungus

2.2.4 加糖量对黑木耳产酸情况的影响

由图5可知，在加糖量为3%～7%范围时，随着糖量的增加，总酸含量逐渐升高，在7%加糖量时达到最大值8.38 g/L。随着加糖量的继续增加，在9%～11%时，总酸含量出现了明显的下降，可能是加糖量过高，渗透压增加，乳酸菌利用不了所导致的。因此，选择加糖量5%、7%和9%进行后续优化试验。

图5 加糖量对黑木耳产酸情况的影响Fig.5 Effects of the sugar addition on acid production of black fungus

2.3 响应面法优化黑木耳乳酸发酵的发酵条件

2.3.1 回归方程建立与方差分析

响应面分析方案及试验结果见表2，试验结果通过Design 8.0.6.1数据分析软件进行回归分析，得到二次回归方程为：

二次多项模型的方差分析见表3，其模型的F值为39.55，说明该模型有意义。P＜0.05，模型极显著，其中X1、X2、X3、X4、X1X2、X1X3、X1X4、X2X4、X3X4、X12、X22、X32均为显著性模型项。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Designs and results of response surface analysis

由表3可知，失拟项的F值为3.37，P＞0.05，表明失拟项相对于纯误差来说不显著。该失拟项说明模型的拟合性较好，可以用于模型分析。模型的校正决定系数为R2=0.950 7，说明95.07%的试验数据的变异性可用此模型来解释。本模型的信噪比＞4，达到了23.415，该模型可用，说明该模型可以用于实际应用中。

2.3.2 最优值的确定

根据多元二次回归方程，以总酸为响应值，对各因素水平进行优化，得到黑木耳乳酸发酵的最佳发酵工艺条件为发酵时间83.99 h、发酵温度36 ℃、接种量3%、加糖量5%。在此条件下总酸的最大预测值为9.96 g/L。

2.3.3 验证试验

为检验试验结果的可靠性，采用上述最优发酵条件进行黑木耳乳酸发酵试验，同时考虑到实际操作的便利，将最佳条件修正为发酵时间84 h、发酵温度36 ℃、接种量3%、加糖量5%。该条件下实际测得的总酸含量为（9.75±0.21）g/L，与预测值相差＜5%。可见，回归方程的预测值与试验值之间具有较好的拟合度。

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

3 结论

植物乳杆菌与短乳杆菌以2∶1的比例混合发酵黑木耳浆时，产酸效果最好。通过单因素试验，确定各因素对黑木耳乳酸发酵产酸情况的影响。通过响应面优化方法，确定黑木耳乳酸发酵的最佳发酵条件为发酵时间84 h、发酵温度36 ℃、接种量3%、加糖量5%。在此条件下的产酸量为（9.75±0.21）g/L。

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