富硒冬虫夏草发酵工艺优化

周坚乔，羊 悦，杨胜利*

（浙江工业大学 药学院，浙江 杭州 310014）

冬虫夏草（Cordyceps sinensis）为我国特有的名贵药用真菌。虫草中含有多种生理活性物质，中医药文献认为冬虫夏草味甘性温，有泌精益气、保肺补肾、止血化痰的功效[1-3]。近代医学临床研究表明，冬虫夏草能治疗劳咳痰血、盗汗、阳痿、遗精、黄胆病、肺结核及老年衰弱、慢性咳喘等症，有强壮兼收敛镇静的效果[4-7]。冬虫夏草所含虫草素能明显增强红细胞黏附肿瘤细胞的能力，抑制肿瘤生长和转移，能明显提升白血球和血小板数量，迅速改善放化疗后的呕吐恶心、胃口差、头发脱落、失眠等症状[8-12]。但天然的冬虫夏草产量十分稀少，因此，采用培养冬虫夏草菌丝体来替代天然冬虫夏草。目前，人工虫草菌丝体的生产多以液体深层发酵为主。随着研究的深入，虫草也被广泛应用于保健食品的开发，如虫草酒、虫草饮料和虫草药膳。目前虫草素的研究现正成为食品保健和药物化学中一个极其活跃的领域。虫草菌深层发酵的产物直接作为食品虽然还未能为人们接受，但被加工成口服液、营养液、食品添加剂、软饮料、含酒精饮料等，已逐渐被人们所接受。虫草液体发酵产物的另一个主要用途是其代谢提取物。即从深层发酵产物中提取多种有效成分，如多糖、多肽、生物碱、萜类化合物、甾醇、苷类、酚类、酶、核酸、氨基酸、维生素等。

硒是人和动物体内必需的一种元素，缺硒可以导致多种症状[13-15]。如人体缺硒会诱发心血管疾病、癌症、克山病及大骨节病等[16-17]，而动物缺硒主要表现为白肌病和生长缓慢等[18-20]。如牛缺硒时，会出现骨骼肌和心肌变性，生长缓慢，消瘦，犊牛腹泻；猪缺硒时，表现为肝营养不良，仔猪出现白肌病、桑堪心、胃溃疡等。硒在菌丝体内主要以硒蛋白和硒多糖的形式存在。其中，硒半胱氨酸是构成某些酶活性中心的重要组分，其作用是充当氧化还原中心。硒多糖具有重要的药理活性如免疫调节、抗肿瘤等。

啤酒糟是啤酒加工副产物，通过微生物将其转化为营养丰富、适口性好、附加值高、经济效益显著的食品添加剂或者微生物饲料是最经济有效的方法之一。废渣中含有大量的营养物质，经微生物发酵后，可转变成更加有效的生物活性物质，作为动物饲料不仅能够提高饲料的营养价值，更能提高畜禽的抗病能力和生产能力。如果将这些活性成分进一步分离纯化，可以作为食品添加剂甚至是药品。

本研究采用冬虫夏草作为富硒的载体，啤酒糟作为基质，进行富硒冬虫夏草液态深层发酵工艺优化。研究冬虫夏草对无机硒的生物转化能力，为富硒冬虫夏草的进一步研究应用打下基础。以虫草为出发菌株，啤酒糟为基质发酵生产相应的产品，不仅能够提高农业副产物附加值，更能创造良好的社会效益。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

冬虫夏草：梁山正大食用菌研究所。

1.1.2 培养基

斜面培养基：马铃薯提取液20%，葡萄糖2%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.15%，琼脂2%。

种子培养基：马铃薯提取液20%，葡萄糖2%，蛋白胨l%，酵母提取物1%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.15%。

发酵培养基：啤酒糟1%～3%，亚硒酸钠（Na2SeO3）10～30 mg/L。

1.1.3 试剂

葡萄糖（分析纯）：上海青析化工科技有限公司；琼脂粉（生化试剂）：国药集团化学试剂有限公司；蛋白胨（生化试剂）：南通东海龙生物制品有限公司；酵母膏（生化试剂）：北京双旋微生物培养基制品厂；磷酸二氢钾（分析纯）：湖州湖试剂化学试剂有限公司；硫酸镁（分析纯）：上海申博化工有限公司；亚硒酸钠（分析纯）：上海鹤善生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

PerkinElmer AAanalvst 800原子吸收分光光度计：美国珀金埃尔默公司；HZQ-2数显全温振荡器、SPX-150智能生化培养箱：常州迈科诺仪器有限公司；CP323S电子天平：德国赛多利斯天平公司；PHS-3C精密pH计：上海精密科学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 种子培养

250 mL摇瓶装液量50 mL，接种斜面菌块，置于摇床中，转速160 r/min，20 ℃培养4 d。

1.3.2 亚硒酸钠添加量的影响

发酵培养基中亚硒酸钠的质量浓度分别为10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L，接种量10%，转速200 r/min，20 ℃培养10 d，测定富硒虫草菌丝体中硒的含量。

1.3.3 啤酒糟添加量的影响

发酵培养基中啤酒糟的质量浓度分别为10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L、30 g/L，接种量10%，转速160 r/min，20 ℃培养10 d，测定富硒虫草菌丝体中硒的含量。

1.3.4 发酵培养条件的优化

在单因素试验基础上，考察pH值、接种量、转速对菌丝体生长和富硒量的影响，选定这3个因素，进行正交试验L9（33），其因素和水平见表1。

表1 冬虫夏草发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for fermentation conditions optimization of Cordyceps sinensis

1.3.5 分析方法

（1）生物量测定

采用干重法。发酵液经4 000 r/min离心15 min去除上清液，菌丝体用去离子水洗涤3次后离心，置于烘箱内60 ℃烘干至质量恒定后称质量。

（2）硒含量测定

采用原子吸收分光光度法测定菌丝体中硒的含量。

2 结果与分析

2.1 富硒虫草菌丝体的生长

将培养好的种子液按10%的接种量。接入装有50 mL发酵培养基的250 mL锥形瓶中，在160 r/min、20 ℃条件下培养。每隔1 d取样测定菌丝体干质量，以生物量（菌丝体干质量）为纵坐标，发酵时间（d）为横坐标绘制菌体生长曲线，结果如图1所示。

图1 富硒冬虫夏草生长曲线Fig.1 Growth curve of selenium-rich Cordyceps sinensis

由图1可知，培养10 d 内，富硒冬虫夏草菌丝体的生物量随着时间的增加逐渐增长，在第10天达到最大值，第10天之后菌体出现自溶，因此，后续试验选择培养时间为10 d。

2.2 啤酒糟添加量对冬虫夏草菌丝体富硒量的影响

以冬虫夏草为出发菌株，优化啤酒糟的质量浓度，分别选择10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L 和30 g/L，添加25 mg/L Na2SeO3，pH值为6，接种量为10%，在温度为20 ℃，摇瓶转速为160 r/min条件下培养10 d，考察啤酒糟的添加量对虫草菌丝体富硒量的影响，结果如图2所示。

图2 啤酒糟添加量对虫草生物量和富硒量的影响Fig.2 Effect of beer distiller’s grains’addition on biomass and selenium accumulation amount

由图2可知，随着啤酒糟质量浓度的增加，生物量和富硒量都在增加，啤酒糟质量浓度在20 g/L 达到最大值。从实验过程来看，随着啤酒糟质量浓度的增加，培养基也逐渐变黏稠，啤酒糟质量浓度＞30 g/L，培养基的流动性受到影响，因此，影响到养分的传递和吸收，也会影响代谢产物的释放。同时虫草菌是好氧菌，也对溶氧受到影响，将直接影响生物量和富硒量。因此选择啤酒糟质量浓度为20 g/L。

2.3 亚硒酸钠添加量对冬虫夏草菌丝体富硒量的影响

以冬虫夏草为出发菌株，啤酒糟质量浓度为20 g/L，pH值为6，接种量为10%，在温度为20 ℃，摇瓶转速为160 r/min条件下，培养10 d，考察发酵培养基中亚硒酸钠的质量浓度分别为10 mg/L、15 mg/L、20 mg/L、25 mg/L、30 mg/L对虫草菌丝体富硒量的影响，结果如图3所示。

图3 亚硒酸钠添加量对冬虫夏草菌丝体富硒量的影响Fig.3 Effect of sodium selenite addition on selenium accumulation in Cordyceps sinensis

由图3可知，随着亚硒酸钠质量浓度的升高，富硒量也在增加，但增加到一定程度又开始下降，可能是因为高浓度的亚硒酸钠有剧毒。当培养基中亚硒酸钠质量浓度为10～25 mg/L时，虫草可以生长并在菌丝体内富集硒，说明虫草对低浓度的亚硒酸钠具有耐受性，并且最适亚硒酸钠添加量为25 mg/L。

2.4 发酵条件对虫草菌丝体富硒量的影响

为考察不同发酵条件对菌丝体生长和富硒量的影响，试验选pH值、接种量、转速3因素，在装液量为50 mL/250 mL，发酵温度20 ℃，加亚硒酸钠质量浓度25 mg/L，啤酒糟质量浓度20 g/L，培养时间10 d的条件下，进行L9（33）正交试验，在参考已知文献及前期试验的基础上，以总富硒量（菌丝干质量×硒含量）为评价指标，优化液态深层发酵工艺。正交试验结果见表2，方差分析见表3。

表2 冬虫夏草液态深层发酵条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for submerged fermentation conditions optimization of Cordyceps sinensis

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表2可知，各因素对虫草菌丝体的生长和富硒量的影响作用大小为转速＞接种量＞pH值。确定冬虫夏草菌丝体的富硒量的最佳工艺条件为A2B3C3，即pH值为7，接种量15%，转速为180 r/min。在此优化条件下进行验证试验，总富硒量为5 808.20 μg/L。

由表3可知，各因素对虫草菌丝体富硒量影响大小顺序为C（转速）＞B（接种量）＞A（pH值），摇床转速对结果的影响有显著影响，而接种量和pH值对结果无显著影响。

3 结论

富硒微生物是一种高效、安全、营养均衡的补硒制剂。富硒冬虫夏草更是具有有机硒的功能，同时具有冬虫夏草的保健活性，目前多以牛肉膏蛋白胨等价格较贵的材料作为基质，而以廉价的啤酒糟作为基质生产很少。其工艺的优化是一个非常复杂的动态过程，影响其结果的因素也很多，本研究通过单因素试验和正交试验，得到优化发酵条件为摇床转速为180 r/min，培养10 d，装液量为50 mL/250 mL，pH值为7.0，接种量15%，温度20 ℃，亚硒酸钠质量浓度25 mg/L，啤酒糟质量浓度20 g/L。在此条件下，虫草总富硒量为5 808.20 μg/L。本试验确定冬虫夏草富硒的最佳发酵条件，为以后的研究提供了一定的基础，今后可进一步选育出优良的冬虫夏草菌株应用到发酵生产中。

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