一株产酸性α-淀粉酶菌株的筛选及酶学性质研究

权淑静，解复红，马 焕，刘德海 *，陈国参

（1.河南省工业酶工程技术研究中心，河南 郑州 450008；2.河南省科学院生物研究所有限责任公司，河南 郑州 450008）

α-淀粉酶是一种催化淀粉内部α-1，4-糖苷键水解，释放出葡萄糖及不同长度直链或支链低聚糖的胞外酶。该酶广泛应用于淀粉深加工、酿酒、酒精生产、食品、纺织、饲料及医药等行业。按照酶的活性、最适pH可分为酸性、碱性和中性α-淀粉酶3种，大多数α-淀粉酶为中性[1]，在酸性条件下酶活明显降低，已不能满足一些酸性条件下淀粉原料的深加工工艺的要求。

随着商业需求的增加，通过α-淀粉酶生产高质量麦芽糖的需求也在不断增加[2]，目前用于淀粉加工的淀粉酶最适pH值为6.8，液化过程需要将淀粉浆从其原有的pH值为3.2～4.5提高至5.8～6.2，此外，添加Ca2+以提高酶的活性和稳定性。接下来的糖化步骤需要调整pH值至4.2～4.5。这些步骤耗费时间和成本。因此，需要适应极端酸性环境的高活性淀粉酶产品[3-4]。

近年来，国内外对耐酸性α-淀粉酶进行了广泛的研究，并相继发现多种细菌、真菌、酵母菌可产生耐酸性α-淀粉酶，最适pH大多在4.0～6.0。我国开展相关研究起步较晚，目前主要集中在菌种选育和构建基因工程菌等方面，所选菌株的产酶活力不高且缺乏可靠的安全性。为了满足工业化生产需要，本实验从酒曲中筛选一株产耐酸性α-淀粉酶的菌株，并对酶的组成成分和酶学性质进行了研究，为工业化应用提供重要的基础理论。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品来源

河南省王勿桥醋业有限公司酿造用砖曲。

1.1.2 培养基

富集培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，1%链霉素3mL/L。

平板分离培养基：KH2PO41.0g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，蛋白胨5.0g/L，葡萄糖10.0g/L，琼脂18.0g/L，pH5.0，1%孟加拉红水溶液3.3mL/L。临用时每100mL培养基中加1%链霉素液0.3mL。

液体发酵培养基：可溶性淀粉40.0g/L，尿素2.0g/L，蛋白胨2.0g/L，KH2PO43.0g/L，CaCl20.1g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，MgSO4·7H2O 1.0g/L，pH5.0。

斜面保藏采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂18g/L。

1.1.3 试剂

2×TaqPCR MasterMix：天根生化科技（北京）有限公司；通用引物NS1、NS8：深圳华大基因科技有限公司；Trans2K plus：北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖：北京恒奥生物科技有限公司；蛋白胨：英国OXOID公司；其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Multifuge X1R离心机：德国Thermo公司；Phenom proX台式扫描电镜：美国FEI公司；T6新世纪紫外可见光分光光度计：北京普析通用仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 产耐酸性α-淀粉酶真菌菌株的筛选

平板分离：将砖曲在30W紫外灯下照射30min表面消毒，用无菌刀在内部多点取样并混匀。取1g粉末于富集培养基中，30℃、180r/min富集培养24h。取培养液分别稀释成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6五个不同梯度与平板分离培养基混合倒平板，30℃恒温培养3～5d，挑取单菌落保藏至斜面。

菌株筛选：将分离到的菌株接入液体发酵培养基，30℃、180r/min培养3d后测酶活。将酶活最高的菌株作为进一步研究的出发菌株。

粗酶液的制备：将发酵液经4层灭菌纱布过滤后，8 000r/min离心10min，取上清液。

酶活测定方法参照文献[5]：180μL底物加入20μL酶液，对照（CK）为20μL缓冲液，在一定温度条件下反应10min，加入200μL 3，5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）试剂，沸水浴5min终止反应，冷却后加蒸馏水2.1mL，在波长520nm条件下测定吸光度值。

酶活力定义：70℃、pH 3.6条件下每分钟从1%可溶性淀粉中释放1μmol葡萄糖所需的酶量为一个酶活单位（U）。

相对酶活的测定：相对酶活是以同组实验中活性最高点的值为100%，其余实验点的值与该点的值之比，通常以百分数表示。

1.3.2 菌株的鉴定

（1）形态观察[6]。

将分离纯化的菌株点种在PDA固体培养基平板上30℃培养48h，观察其菌丝生长情况，菌落形态、边缘、菌丝长度和颜色（正面、反面）；直接制片观察法观察孢子、菌丝形态。

（2）分子生物学鉴定

真菌DNA的提取采用十六烷基三甲基溴化铵法（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法[7]。

菌株18S rDNA：PCR扩增采用引物为：NS1（5′-GTA GTCATATGCTTGTCTC -3′）；NS8（5′-TCCGCAGGTTC ACCTACGGA-3′）。

PCR扩增体系为50μL，包括无菌双蒸水19μL，正向和反向引物各2.0μL，模板DNA 2.0μL，2×TaqPCR MasterMix 25μL。

反应体系：每个反应30个循环，每个循环包括94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1.5min；最后72℃延伸10min，首次循环在95℃预变性2min。

将聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送华大基因测序。通过GenBank数据做相似性分析。

1.3.3 粗酶液酶学性质初步研究

酶反应最适温度：将离心后的粗酶液稀释一定倍数，与底物在不同温度下进行反应，温度梯度设置为30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，测定酶活，确定最适温度。

酶反应温度稳定性：将稀释适当倍数的粗酶液分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃保温1h，最适温度条件下测定剩余酶活。

酶反应最适pH：用pH分别为3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0的缓冲液配制底物1%淀粉溶液，用相应pH的缓冲液测定酶活（NaH2PO4-柠檬酸缓冲体系）。

酶反应pH稳定性：将酶液用相应pH的缓冲液稀释至适当倍数，在50℃保温1h，70℃测定剩余酶活。

金属离子对酶活力的影响：在反应体系中分别加入2mmol/L的乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、Mg2+、Ca2+、Ba2+、Zn2+、Fe3+、Mn2+、K+、Co2+，测定酶活。

2 结果与分析

2.1 产酸性α-淀粉酶淀粉酶菌株筛选

经过筛选获得了6株酶活较高的产α-淀粉酶菌株，粗酶液的酶活见表1。由表1可以看出，A-5-3的酶活最高，达到282.38U/mL，因此确定A-5-3为出发菌株。

表1 产α-淀粉酶菌株筛选结果Table 1 Screening results of strain with α-amylase high yield

2.2 菌种鉴定

2.2.1 形态学观察

将菌株A-5-3接种至PDA培养基上培养2d，观察其形态特征结果见图1。由图1可知，菌落生长速度快，菌落初期为淡黄色，有褶皱；后期菌落中央黄色，边缘为白色菌丝，背面黄色。产生大量黑色分生孢子。结合显微观察和电镜下观察结果见图2，初步鉴定为黑曲霉（Aspergillus niger）。

图1 菌株A-5-3菌落形态特征Fig.1 Colonial morphological properties of strain A-5-3

图2 分生孢子梗、分生孢子头及分生孢子的扫描电镜图Fig.2 Scanning electron microscope of conidiophore,conidial head and conidia

2.2.2 18s rDNA基因的PCR扩增

以提取的A-5-3的DNA为模板，以NS1、NS8为引物进行PCR扩增。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图3，得到一条1 500bp左右的片段。将PCR产物送华大基因测序，结果显示该片段长1 448bp，将测序结果用美国国家生物技术信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）的Blast软件进行核苷酸同源性比对，得知该菌株与黑曲霉的18S rDNA的序列同源性为100%，因此将该菌株归属为黑曲霉（Aspergillus niger）。

图3 PCR扩增的18S rDNA电泳图Fig.3 Electrophoretogram of PCR amplified 18S rDNA

2.3 菌株A-5-3产酸性淀粉酶性质研究

2.3.1 温度对酶活力的影响

在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃测定粗酶液酶活，测得淀粉酶活性最大值为100%，结果见图4。

图4 温度对酶活力的影响Fig.4 Effect of temperature on enzyme activity

由图4可知，菌株A-5-3所产淀粉酶反应的最适温度为70℃。

2.3.2 酶的热稳定性研究

粗酶液在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃保温1h后，进行酶促反应，以不保温酶液为对照，对照相对酶活值为100%，结果见图5。

图5 温度对酶的稳定性影响Fig.5 Effects of temperature on enzyme stability

由图5可以看出，在30℃、40℃、50℃条件下，该酶的热稳定性好，保温1h后，剩余的相对酶活分别达到95.53%、98.55%、97.11%。当温度高于60℃时，酶活下降很快，到80℃时，剩余淀粉酶活力仅剩下最高酶活力的15%。

2.3.3 pH值对酶活力的影响

在pH 3.0、3.6、4.0、4.6、5.0、5.6、6.0、6.6、7.0条件下测酶活，结果见图6。以活性最大值为100%，由图6可知，酶的最适pH为3.6，pH 4.0、4.6时相对酶活分别为99.73%和99.69%，pH＞5.0时酶活迅速降低，pH值为3.0时相对酶活为71.12%。

2.3.4 酶的pH稳定性研究

将酶液用不同pH值的缓冲液处理后测剩余酶活，结果见图7。以未经过处理的原酶液活力为100%，考察该酶的pH稳定性，由图7可知，该酶在pH 3.0～5.0非常稳定，相对酶活≥85%。在pH＞6.0条件下，相对酶活力降低至50%以下。

图6 pH值对酶活力的影响Fig.6 Effect of pH on enzyme activity

图7 pH值对酶的稳定性影响Fig.7 Effect of pH on enzyme stability

2.3.5 金属离子对酶活力的影响

在反应体系中加入一定浓度的EDTA、MgCl2、CaCl2、BaCl2、ZnCl2、FeCl3、MnCl2、KCl、CoCl2溶液，使其在反应体系中的浓度达到2mmol/L，以未处理原酶液为对照（CK）100%，考察金属离子对酶活力的影响，结果见图8。由图8可知，Mn2+、K+对酶活有明显的激活作用，相对酶活达到153%和121%；EDTA对酶活有明显的抑制作用，相对酶活降至81%；Ca2+及其他金属离子对酶活没有明显影响。

图8 金属离子对酶活力的影响Fig.8 Effect of metal ions on enzyme activity

3 结论

α-淀粉酶是水解淀粉酶类，是商品化生产最早、应用最早、应用范围最广和用量最大的工业酶类之一。耐酸性α-淀粉酶作为一种极端环境淀粉酶，可广泛应用于发酵、纺织、饲料、医药等多种领域，可以明显地提高收得率，降低消耗，节约工业成本，具有很大的应用潜力和开发前景。目前工业用的酸性α-淀粉酶大多来源于微生物，产酸性α-淀粉酶的微生物主要是芽孢杆菌和曲霉[8]，如酸热脂环酸芽孢杆菌（B.acidocaldarius）A-2[9]，酸热脂环酸芽孢杆菌（B.acidocaldarius）ATCC2709[10]，地衣芽孢杆菌（B.licheniformis）[11]，酸热脂环酸芽孢杆菌（B.acidocaldarius）101[12]，酸热脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidocaldarius）[13]，黑曲霉（Aspergillus niger）[14]，白曲霉（Aspegillus kawachii）[15]，疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyoes lanuginosus）[16]，嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus steorothermopilius）[17]等。黑曲霉是最早发现能够产耐酸性α-淀粉酶的菌株，在日本、欧洲等国已经有用其进行工业化应用的报到。虽然这些微生物都能产生酸性α-淀粉酶，但是不同菌株产生的酶在耐酸性，耐热性及淀粉的水解程度均有差异。大多数的酸性α-淀粉酶的最适反应温度为50～60℃，其最适pH值为4.0～5.0。

本研究从酿造酒曲中分离筛选出的高产组选育的α-淀粉酶菌株A-5-3，经初步鉴定为黑曲酶（Aspergillus niger）。通过对其产生α-淀粉酶的酶学性质的研究，表明该酶的最适作用温度为70℃，热稳定性良好；最适作用pH值为3.6，该酶在pH 3.0～5.0范围内酶活稳定，当pH 3.0时，有71%的酶活；Mn2+、K+离子对此酶有激活作用，EDTA有明显的抑制作用，Ca2+对该酶没有明显的作用。与国内已报道文献相比，该酶的活力较高，且不依赖Ca2+调控，能够实现在弱酸性条件下淀粉液化和糖化的同步进行，从而简化了淀粉加工工艺，节约了成本，具有良好的应用前景。

[1]PANDEY A,NIGAM P,SOCCOL C R,et al.Advances in microbial amylases[J].Biotechnol Appl Bioc,2000,31(2):135-152.

[2]FOGARTY W M,COLLINS B S,DOYLE E M,et al.The high maltose-formingα-amylase ofSaccharomonospora viridis:mechanisms of action[J].J Ind Microbiol,1993,11(3):199-204.

[3]SHIVARAMAKRISHNAN S,GANGADHARAN D,NAMPOOTHIRI K M,et al.α-amylases from microbial sources-an overview on recent developments[J].Food Technol Biotech,2006,44(2):173-184.

[4]ARCHANA S,SATYANARAYANA T.Microbial acid-stableα-amylase:characteristics,genetic engineering and applications[J].Process Biochem,2013,48(2):201-211.

[5]XIE F H,QUAN S J,LIU D H,et al.Purification and characterization of a novelα-amylase from a newly isolatedBacillus methylotrophicusstrain P11-2[J].Process Biochem,2014,49(1):47-53.

[6]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科技出版社，1979.

[7]孙立夫，张艳华，裴克全.一种高效提取真菌总DNA 的方法[J].菌物学报，2009，28（2）：299-302.

[8]MORIMURA S,ZHANG W X,LCHIMURA T,et al.Genetic engineering of white shochu-koji to achieve higher levels of acid-stableα-amylase and glucoamylase and other properties when used for shochu making on a laboratory scale[J].J I Brewing,1999,105(5):309-314.

[9]KANNO M.A Bacillus acidocaldarius alpha-amylase that is highly stable to heat under acidic conditions[J].Agr Biol Chem,1986,50(1):23-31.

[10]CRABB W D,MITCHINSON C.Enzymes involved in the processing of starch to sugars[J].Trends Biotechnol,1997,15(9):349-352.

[11]Oziengbe E O,Onilude A A.Production of a thermostableα-amylase and its assay usingBacillus licheniformisisolated from excavated land sites in Ibadan,Nigeria[J].Bayero Journal of Pure and Applied Sciences,2012,5(1):132-138.

[12]BUONOCORE V,CAPORALE C,DE ROSA M,et al.Stable,inducible thermoacidophilic alpha-amylase fromBacillus acidocaldarius[J].JBacteriol,1976,128(2):515-521.

[13]EEKERT K,SCHNEIDER E.A thermoacidophilic endoglucanase(CelB) fromAlicyclobacillus acidocaldariusdisplays high sequence similarity to arabinofuranosidases belonging to family 51 of glycoside hydrolases[J].Eur J Biochem,2003,270(17):3593-3602.

[14]OKOLO B N,EZEOGU L I,MBA C N.Production of raw starch digesting amylase byAspergillus nigergrown of native starch sources[J].J Sci Food Agr,1995,69(1):109-115.

[15]SUDO S,ISHIKAWA T,SAKAMOTO Y,et al.Characteristics of acid-stableα-amylase production by submerged culture ofAspergillus kawachii[J].J Ferment Bioeng,1993,76(2):105-110.

[16]PETROVA S D,LLIEVA S Z,BAKALOVA N G,et al.Production and characterization of extracellularct-amylase from the thermophilie fugusThermomyees lanuginosus(wild and mutant strains)[J].Biotechnol Lett,2000,22(20):1619-1624.

[17]KAMASAKA H,SUGIMOTO K,TAKASHI K,et al.Bacillus stearothermophilusneopullulanase selective hydrolysis of amylose to maltose in the presence of amylopectin[J].Appl Environ Micro,2002,68(4):1658-1664.