以糖蜜为碳源的酿酒酵母培养基的优化

陈雪，甄玉国，2*，赵小丽

以糖蜜为碳源的酿酒酵母培养基的优化

陈雪1，甄玉国1，2*，赵小丽1

（1.吉林农业大学动物科学技术学院吉农博瑞奶牛研发中心，吉林长春130118；2.长春博瑞饲料集团有限公司技术中心，吉林长春130114）

以甜菜糖蜜为碳源，通过摇瓶试验，在单因素试验基础上，进行正交试验设计，对酿酒酵母的培养基进行了优化。最终确定酿酒酵母的液体培养基优化配方为糖蜜添加量8%，尿素添加量0.05%，磷酸二氢钾添加量0.05%。在此条件下的培养基产酿酒酵母菌干质量为7.67g/L，比培养基优化前提高了23.3%。

甜菜糖蜜；酿酒酵母；培养基；优化

酵母菌（yeast）不是一个分类单位，其属于子囊菌亚门中的酵母菌科和半知菌亚门中的芽孢纲，菌体为单一细胞，主要以芽殖方式进行无性繁殖[1]。酵母培养物（yeast culture，YC）是指在特定工艺条件下由酵母菌在培养基上经过充分的厌氧发酵后形成的微生态制品，主要由酵母细胞外代谢产物、经发酵后变异的培养基和少量无活性的酵母细胞构成[2]。

酵母菌生长主要受碳源、氮源、生长因子和无机离子等培养基组分的影响。传统培养基质大多用价格较高的酵母粉和蛋白胨，糖蜜作为制糖厂的废料，价格低廉，来源广泛。甜菜糖蜜是糖厂的副产品，可发酵性糖的含量一般为30%～60%，除此之外，还含有一定的可发酵性氮、多种无机盐及维生素，是酵母生产中比较理想的碳源[3]。以甜菜糖蜜为主要碳源，以期获得较高酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）生物量的培养基配方，为将来优选酿酒酵母的培养及酵母饲料工业化生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料

酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）：动物科学技术学院实验室分离保存。

甜菜糖蜜：黑龙江依安糖厂。

葡萄糖、磷酸二氢钾、尿素、硫酸铵、硫酸镁、氯化钠、氯化钙（以上均为分析纯）：北京化工厂；蛋白胨（总氮≥14.5%，酵母浸粉：总氮≥9%）：北京奥博星生物技术有限公司。

1.1.2 培养基

斜面培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L，琼脂15g/L。

液体培养基采用酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母浸粉10g/L）用于种子液培养[4]。

1.2 仪器与设备

pHS-2C型数字式酸度计：上海SANXIN公司；UV-1201分光光度计：日本岛津公司；Eppendorf 5810R高速冷冻离心机：德国艾本德股份公司；YP1200型电子天平：上海精科实业有限公司；HYG-C型培养摇床：上海欣蕊自动化设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种活化与种子液制备

无菌条件下接1环保藏菌种至YPD斜面培养基进行划线，30℃静置培养48h复苏菌种。

取复苏后的菌种，用接种环取1环活化后的斜面菌种转接到种子培养基中于30℃、180r/min条件下培养24h（装液量100mL/250mL）。

1.3.2 分析方法

菌液浓度采用比浊法测定：用紫外可见分光光度计以不接入菌液的培养基作为对照，测定菌液在波长560nm处的光密度值OD560nm值[5]。

测定菌体干质量采用干重法测定：发酵液在5 000r/min条件下离心10min，蒸馏水洗涤2次后收集菌体，105℃烘干至质量恒定，称质量并记录数据[6]。

1.3.3 试验菌株生长曲线测定

斜面保存的菌种用接菌环挑取1环于YPD培养基中，装液量200mL/500mL，在温度30℃、180r/min的条件下培养，每隔2h取样，在波长560nm条件下测定其OD560nm值，以时间为横坐标，OD值为纵坐标绘制生长曲线，选择对数期生长的菌液进行后续试验[7]。

1.3.4 培养基优化单因素试验

（1）糖蜜添加量的筛选

培养初始条件：接种量4%，装液量20mL/100mL三角瓶，温度30℃，180r/min，pH5.0，培养24h。以糖蜜作为试验菌种的碳源，分别选取糖蜜添加量4%、6%、8%、10%、12% 5个梯度进行试验，每组5个平行，利用可见分光光度计在波长560nm条件下测定其吸光度值OD560nm。

（2）培养基最适氮源的筛选[8]

氮源分为有机氮和无机氮，为保持菌种的正常生长在选取的碳源基础上添加适量的氮源，选取的氮源分别为尿素、硫酸铵和蛋白胨，培养初始条件不变，在保持氮元素添加量水平相同的情况下，添加量分别为尿素0.10%、硫酸铵0.22%、蛋白胨0.33%，以糖蜜培养基为对照组，每组5个平行，在波长560nm条件下测定其OD560nm值。

（3）最适氮源添加量的确定

氮源确定后选取0.05%、0.10%、0.20%、0.30%、0.40%5个梯度进行单因素试验，每组5个平行，在波长560nm条件下测定其OD560nm值。

（4）培养基中磷酸盐的筛选

培养初始条件不变，选取磷酸二氢钾为磷酸盐，磷酸二氢钾是酵母代谢中一些关键酶的辅助因子（如果糖激酶等），同时也是维持电位差和渗透压的重要物质[9]。选取磷酸二氢钾0.01%、0.05%、0.10%、0.20%4个梯度进行单因素试验，以糖蜜培养基为对照组，每组5个平行，在波长560nm条件下测定其OD560nm值。

（5）糖蜜培养基中无机盐的筛选

无机盐是酵母菌生长必不可少的营养物质，培养基中添加无机盐可促进酵母菌的生长，提高细胞生物量[10]。在确定碳源、氮源和磷酸盐添加量的基础上，分别添加0.05%硫酸镁、0.05%甘氨酸、0.05%氯化钠、0.05%氯化钙，判定其是否对菌体生长有促进作用，以糖蜜培养基为对照，每组5个平行，在波长560nm条件下测定其OD560nm值。

（6）糖蜜培养基中生长因子的筛选

选取酵母浸粉为生长因子，生长因子主要是调节微生物代谢活动的，是微生物不可缺少的微量有机元素[11]。选取0.01%、0.05%、0.10%、0.20%4个梯度进行单因素试验，以糖蜜培养基为对照，每组5个平行，在波长560nm条件下测定其OD560nm值。

1.3.5 培养基配方优化正交试验

在单因素试验基础上，选取对菌体浓度影响较大的因素设计L9（34）正交试验，以OD560nm值为考察指标，对其培养基组分进行优化。

1.3.6 数据处理

用SPSS 17.0软件对实验数据进行单因素方差分析，采用Duncan检验，各组数据以χˉ±s表示。

2 结果与分析

2.1 酵母菌生长曲线

图1 酵母菌生长曲线Fig.1 Growth curve ofSaccharomyces cerevisiae

由图1可知，通过对酵母菌的生长曲线分析可知，0～6h为迟缓期，菌体生长较慢。6～16h为对数期，16h后进入稳定期，为保证得到足够数量的菌体，因此选择18h左右的菌体进行培养基的单因素筛选。

2.2 糖蜜添加量的确定

由图2可知，在糖蜜添加量小于10%时，酵母菌的浓度随糖蜜添加量的提高而增大，当糖蜜添加量大于10%时酵母菌的生长受到抑制，这与王鹏等[12]的研究结果相一致。糖蜜添加量为6%、8%、10%、12%时，各组之间差异不显著（P＞0.05），但与4%的糖蜜添加量均差异显著（P＜0.05），同时从经济因素和原料的转化率方面考虑，糖蜜添加量选择6%为最适。

图2 糖蜜添加量对OD560nm值的影响Fig.2 Effect of molasses concentration on OD560nm

2.3 氮源的确定

图3 不同氮源对OD560nm值的影响Fig.3 Effect of nitrogen source on OD560nm

由图3可知，与不添加任何氮源的对照组相比，添加量为0.10%尿素组OD560nm值显著升高（P＜0.05），0.22%硫酸铵组OD560nm值显著降低（P＜0.05），0.33%蛋白胨组OD560nm值虽升高但无显著性差异（P＞0.05）。因此确定尿素为氮源。

2.4 尿素添加量的确定

图4 尿素添加量对OD560nm值的影响Fig.4 Effect of urea concentration on OD560nm

由图4可知，不同梯度尿素添加量的各组间吸光度值差异均不显著（P＞0.05），由于糖蜜中的蔗糖、还原糖和棉实糖都是可以被微生物利用的碳源，但是只有部分的氮能够被酵母利用[13]，其中的含氮量不能完全的满足酵母菌的生长，必须添加氮源，但也无需太多，从节约成本考虑确定尿素的添加量为0.05%。

2.5 磷酸二氢钾添加量的确定

图5 磷酸二氢钾添加量对OD560nm值的影响Fig.5 Effect of KH2PO4concentration on OD560nm

由图5可知，与对照组相比，各组均无显著性差异（P＞0.05），不同添加量组的OD560nm值均高于对照组，0.05%组增加的趋势较明显，而添加量为0.10%组的OD560nm值较0.01%组和0.05%组有所降低，所以磷酸二氢钾的适宜添加量为0.05%。结果表明，适量添加磷酸二氢钾可以促进酵母菌的生长，提供细胞生长所需要的磷和钾，同时也起到了一定的缓冲作用，添加过量则会抑制酵母菌的生长。

2.6 酵母浸粉添加量的筛选

图6 酵母浸粉添加量对OD560nm值的影响Fig.6 Effect of yeast extract powder addition on OD560nm

由图6可知，与对照组相比，各组均无显著性差异（P＞0.05），这是由于糖蜜成分复杂，除提供菌体生长所必需的碳源外，还含有其他丰富的营养物质如矿物质、维生素等[14-15]，因此糖蜜培养基中不需要添加酵母浸粉。

2.7 无机盐添加量的筛选

由图7可知，由于糖蜜中本身含有丰富的无机盐，与对照组相比，各组均无显著性差异（P＞0.05），且不同程度的抑制了酵母菌的生长，说明糖蜜培养基中不需要添加无机盐。

2.8 酿酒酵母培养基优化正交试验分析

在单因素试验基础上，选择糖蜜添加量、尿素添加量、磷酸二氢钾添加量3个因素进行正交试验，正交试验因素与水平见表1，结果与分析见表2，方差分析见表3。

图7 无机盐添加量对OD560nm值的影响Fig.7 Effect of inorganic salts addition on OD560nm

表1 酿酒酵母培养基配方优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for medium formula optimization ofSaccharomyces cerevisiae

表2 酿酒酵母培养基配方优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization ofSaccharomyces cerevisiae

表3 酿酒酵母培养基优化正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments for medium formula optimization ofSaccharomyces cerevisiae

由表2可知，影响酿酒酵母菌OD560nm值的主次顺序为RA>RB>RC，即糖蜜添加量对酵母菌OD560nm值影响最为显著，然后依次为尿素和磷酸二氢钾添加量。酵母菌最优培养基组合为A3B2C2，即糖蜜8%、尿素0.05%、磷酸二氢钾0.05%。在此最佳条件下，OD560nm值为22.364，酵母菌的干质量达到7.67g/L，比未优化培养基提高了23.3%。

由表3可知，糖蜜添加量对酵母菌OD560nm值影响显著，尿素和磷酸二氢钾添加量对酵母菌OD560nm值影响不显著。

3 结论

本研究以糖蜜为碳源，实验室分离出的酿酒酵母为试验菌株，在单因素试验基础上进行正交试验，对酿酒酵母的培养基进行优化，最终优化的培养基配方为糖蜜添加量8%，尿素添加量0.05%，磷酸二氢钾添加量0.05%。在此最佳培养条件下，培养的酵母菌干质量达到7.67g/L，比未优化培养基条件下的酵母菌干质量提高了23.3%。

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Optimization ofSaccharomyces cerevisiaemedium with molasses as carbon source

CHEN Xue1,ZHEN Yuguo1,2*,ZHAO Xiaoli1
(1.JAU-Borui Dairy Science and Technolgy R&D Center,College of Animal Science and Technology,Jilin Agricultural University, Changchun 130118,China;2.Technolgy Center of Changchun Borui Feed Co.,Ltd.,Changchun 130114,China)

Usingbeetmolassesascarbon source,based on shake flask test,on the basis of single factor experiments,orthogonal experiment was adopted to optimize the formula ofSaccharomyces cerevisiaemedium.The optimum formula was determined as follows:beet molasse 8%,urea 0.05%,monopotassium phosphate 0.05%.Under the optimized condition,the cell weight reached 7.67 g/l,which was 23.3%higher than the non-optimized one.

beet molasse;Saccharomyces cerevisiae;medium;optimization

TS261.1

A

0254-5071（2014）04-0035-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.009

2014-03-06

吉林省重大科技攻关项目资助（No.2012ZDGG006）

陈雪（1990-），女，硕士研究生，研究方向为反刍动物营养。*

甄玉国（1970-），男，副教授，博士，研究方向为反刍动物营养。