不同条件对炭黑曲霉产赭曲霉毒素A能力的影响

陈伦佳，王婧，韩舜愈，宋蕤，陈凯

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070）

不同条件对炭黑曲霉产赭曲霉毒素A能力的影响

陈伦佳，王婧，韩舜愈*，宋蕤，陈凯

（甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃兰州730070）

为了解一株分离自新疆葡萄园的炭黑曲霉菌株在不同培养条件下产生赭曲霉毒素A（OTA）的能力，试验采用孟加拉红培养基，利用高效液相-荧光法对OTA进行定量检测，在单因素试验的基础上，采用响应面法优化产毒条件。结果表明，对该菌株产生OTA的条件影响从大到小依次为葡萄糖质量浓度、乙醇体积分数、SO2质量浓度。最优产毒条件：在温度28℃条件下，葡萄糖质量浓度92.26g/L、SO2质量浓度8.26mg/L、乙醇体积分数0.05%。在此条件下，OTA产量为7.427ng/mL。

赭曲霉毒素A；炭黑曲霉CXT11；产毒条件；响应面

赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）是曲霉菌属（Aspergillus）和青霉菌属（Penicillium）的某些种产生的次级代谢产物，其代表菌为炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius）、赭曲霉（Aspergillus ochraceus）以及疣孢青霉（Penicillium verrusosum）[1]。OTA是一种无色结晶化合物，具有耐热性，易溶于稀的碳酸氢钠溶液和极性有机溶剂，微溶于水，在紫外光的照射下呈绿色荧光，是由L-β-苯丙氨酸与7-羟基-5-氯-3，4-二氢-8-羟基-3R-甲基异香豆素通过肽键连接而成[2]，分子式为C20H18ClNO6[3]，化学结构见图1。OTA具有耐热性，焙烤只能使其毒性减少20%，蒸煮对其毒性不具有破坏作用[4-5]。

图1 OTA化学结构式Fig.1 Chemical structure of OTA

OTA广泛存在于各种食物中，对人类的危害仅次于黄曲霉毒素，主要危及人和动物肾脏[6]，同时对免疫系统也有毒性，还具有致畸、致癌、致突变作用[7]。国际癌症研究机构将其定义为2B类致癌物[8-9]。OTA在葡萄中的危害仅次于谷物[10]。酿酒葡萄成为葡萄酒中OTA的主要来源。葡萄酒中的OTA由ZIMMERLI B等[11]首次检测出。随后，澳大利亚、法国、西班牙等许多国家都报道了葡萄酒中OTA的存在[12]。因此，各国对葡萄酒中OTA的含量进行了严格规定。欧盟（european union，EU）委员会在2005年制定的相关标准中规定，葡萄酒以及用于饮料制作的葡萄汁中OTA限量为2.0μg/L[13]，而国内标准暂时未确定。

目前已有关于培养温度[14]、时间[15]、水分活度[16-17]、酵母浸膏[18]以及Zn2+、Mg2+[19]等条件对不同产毒菌株产OTA影响的研究，然而，关于总糖、SO2、乙醇等对产毒菌株产OTA影响的研究报道较少。研究以分离自新疆吐鲁番葡萄园的1株炭黑曲霉（Aspergillus carbonarius）为研究对象，通过单因素试验和响应面分析（response surface methodol-ogy，RSM）的方法，研究炭黑曲霉在不同葡萄糖、SO2和乙醇含量等条件下的产毒能力，以期为如何减少葡萄酒中OTA含量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

产OTA炭黑曲霉菌株CXT11分离自新疆吐鲁番葡萄园葡萄浆果，由甘肃农业大学食品学院葡萄酒重点实验室提供；

孟加拉红培养基：蛋白胨5g，葡萄糖10g，磷酸二氢钾1g，硫酸镁（MgSO4·7H2O）0.5g，琼脂20g，1/3 000孟加拉红溶液100mL，氯霉素0.1g，蒸馏水1 000mL。121℃高温灭菌20min；

赭曲霉毒素A标品（纯度98%）：青岛日水生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HPLC2695高效液相色谱仪（装有荧光检测器）：美国Waters公司；Cence H2050R高速冷冻离心机：湖南湘潭湘仪仪器有限公司；SPX-GB光照培养箱：上海跃进医疗器械有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌悬液制备

将供试菌株接种于孟加拉红培养基，25℃培养7d，用无菌水冲洗平板表面收集孢子后，用灭菌的纱布过滤，取0.1mL滴于血球计数板上，在显微镜下观察菌悬液的浓度，调整菌悬液孢子的浓度至3.0×108CFU/mL。

1.3.2 OTA的提取

在无菌条件下，将上述培养的菌液每个样品吸取2mL，加入2mL OTA提取液（甲醇∶水=8∶2，v/v），充分混合，10 000r/min离心10min。取上清液用d=0.22μm的滤膜过滤，用高效液相色谱仪检测。

1.3.3 高效液相色谱法对OTA的定量检测

参考SN/T1940—2007《进出口食品中赭曲霉毒素A的测定方法》[20]并改进。将1mg OTA标品溶于1mL的甲醇水溶液（1∶1，v/v）配制成1mg/mL的OTA原液。吸取10μL该原液稀释于10mL的甲醇水溶液（1∶1，v/v）中，制成1μg/mL的OTA储备液，-20℃保藏备用。

从OTA储备液中分别移取20μL、50μL、100μL、200μL、500μL、1 000μL稀释至10mL，依次得到质量浓度为2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的OTA标品溶液，经高效液相色谱仪检测后绘制标准曲线。

高效液相色谱条件。色谱柱：ACQUITYBEH C18不锈钢柱（1.0mm×50mm×1.7μm）；流动相：甲醇/乙酸铵（80mmol/L）=45∶55，梯度洗脱；流速：1mL/min；柱温：室温；进样量：10μL；荧光检测器：激发波长360nm，发射波长440nm。

1.3.4 单因素试验

选择SO2、乙醇及葡萄糖含量作为影响产毒的主要因素，通过单因素试验选取响应面试验的因素和水平。

（1）培养液SO2质量浓度对产生OTA的影响

吸取1mL 3.0×108CFU/mL菌悬液接种至20mL孟加拉红液体培养基中，分别加入一定量的偏重亚硫酸钠溶液使其质量浓度为0、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L，28℃摇床培养9d。用高效液相色谱仪测定各样品OTA含量。

（2）培养液乙醇体积分数对产生OTA的影响

吸取3.0×108CFU/mL菌悬液1mL接种至20mL孟加拉红液体培养基中，分别加入一定量乙醇溶液使其体积分数为0%，3%、6%、9%、12%，28℃摇床培养9d。用高效液相色谱仪测定各样品OTA含量。

（3）培养液葡萄糖质量浓度对产生OTA的影响

吸取1mL 3.0×108CFU/mL菌悬液接种至20mL孟加拉红液体培养基中，分别加入一定量葡萄糖使其质量浓度相应为50g/L、100g/L、150g/L、200g/L、250g/L，28℃摇床培养9d。用高效液相色谱仪测定各样品OTA含量。

1.3.5 响应面优化炭黑曲霉CXT11产毒条件

根据单因素试验结果，选取葡萄糖质量浓度（X1）、SO2质量浓度（X2）、乙醇体积分数（X3）3个因素作为自变量，以OTA含量为响应值（Y），进行中心组合试验设计。每个试验重复3次，取其平均值，试验因素水平及编码见表1。

表1 响应面试验因素水平编码Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.6 模型的验证

通过响应面法优化炭黑曲霉的产毒条件，并以优化后的条件参数进行培养试验，比较模型预测值和试验值，验证模型的有效性。

1.3.7 数据处理与分析

每个试验重复3次，取其平均值。采用SAS 8.1及Microsoft Excel 2003统计软件进行单因素方差分析和差异显著性分析，采用Design Expert 8.05b软件进行响应面分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线回归方程的建立

用高效液相色谱法检测OTA含量，OTA标准品的高效液相色谱图见图2。以峰面积（Y）为纵坐标，OTA质量浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线见图3。

由图2可知，所得标准曲线线性回归方程式为Y=607.7X+890.49，相关系数R2=0.998 8，表明二者线性关系良好。

图2 OTA标准品的高效液相色谱图Fig.2 HPLC figure of standard ochratoxin A solution

图3 OTA的标准曲线Fig.3 Standard curve of ochratoxin A

2.2 单因素试验结果

2.2.1 培养液中SO2质量浓度对产生OTA的影响

图4 SO2含量对菌株CXT11产毒的影响Fig.4 Effect of SO2content on OTA production by strain CXT11

由图4可知，当培养液中SO2质量浓度在0～25mg/L时菌株CXT11产生OTA的能力反而有一定程度的增加，当SO2质量浓度超过25mg/L时，随着SO2含量的增加，菌株CXT11产毒量呈明显的下降趋势。对于SO2质量浓度在0～25mg/L时OTA少量增加的原因分析，可能是因为SO2的加入降低了溶液的pH，低pH值促进了菌株CXT11产生OTA毒素，说明外源pH环境对OTA的产生具有促进作用。

2.2.2 乙醇体积分数对产生OTA的影响

图5 乙醇体积分数对菌株CXT11产毒的影响Fig.5 Effect of ethanol content on OTA production by strain CXT11

由图5可知，随着乙醇体积分数的增加，菌株CXT11产生OTA的能力呈明显的下降趋势。当乙醇体积分数>10%时，OTA几乎检测不到，说明较高的乙醇体积分数能够抑制菌株产毒。

2.2.3 葡萄糖质量浓度对菌株CXT11产生OTA的影响

图6 葡萄糖含量对菌株CXT11产毒的影响Fig.6 Effect of glucose content on OTA production by strain CXT11

由图6可知，菌株CXT11产OTA量在0～100g/L葡萄糖质量浓度内呈较缓慢的上升趋势，当葡萄糖质量浓度超过100g/L时下降较为明显。这是否因为细胞渗透压的改变而影响了产毒，其原因还有待进一步研究。

2.3 响应面分析法对菌株CXT11产毒条件优化

对葡萄糖质量浓度（X1）、SO2质量浓度（X2）、乙醇体积分数（X3）进行了3因素3水平响应面分析，采用Box-Behnken试验设计方案结果见表2和表3。

利用Design-Expert8.05对表2的试验数据进行方差分析、参数估计及显著性检验，具体结果分析见表3，得到OTA产量与葡萄糖质量浓度、SO2质量浓度、乙醇体积分数的标准三元二次回归方程为：

从表3可知，响应面回归模型达到极显著（P＜0.01）；失拟检验不显著（P＞0.05），说明模型所拟合的二次回归方程与实际相符合，能正确反映OTA产量与X1、X2和X3之间的关系，回归模型可以较好地对优化试验中的各种试验结果进行预测。显著性检验结果表明，二次项中葡萄糖质量浓度、SO2质量浓度与乙醇体积分数均对OTA产量有显著影响（P＜0.05）。一次项中葡萄糖质量浓度与乙醇体积分数对OTA产量有显著影响（P＜0.05）。决定系数R2为0.927 3，说明模型的拟合度好，OTA的实际值与预测值之间具有较好的拟合相关性。方差分析结果表明，各因素对真菌产OTA毒素影响由大到小顺序依次为葡萄糖质量浓度、乙醇体积分数、SO2质量浓度。

表2 响应面分析试验设计方案及结果Table 2 Design and result of response surface analysis experiment

表3 回归模型方差分析及其系数的显著性检验Table 3 Variance analysis of regression model and coefficient of significance test

对葡萄糖质量浓度、SO2质量浓度、乙醇体积分数3个因素，两两交互作用分析，得到交互因子的响应曲面图及等高线见图7。等高线图表示在同一椭圆型的区域内，OTA产量是相同的。在椭圆形区域中心，OTA产量最低，由中心向边缘逐渐增大。椭圆排列越密集，说明因素变化对OTA产量影响越大。同时等高线的形状可以反映出交互作用的大小，椭圆形表示两因素交互作用显著；而圆形则与之相反，此时两因素交互作用不显著。由图6可知，两两交互作用分析，两者之间的交互作用皆不显著。

图7 各因素对OTA产量影响的响应曲面和等高线Fig.7 Response surface plot and contour line of interaction factors on ochratoxin A production

通过回归方程对各因素求最大值，得出菌株CXT11产OTA的最佳参数为葡萄糖质量浓度92.26g/L、SO2质量浓度8.26mg/L、乙醇体积分数0.05%。在此最优条件下，得OTA产量为7.596ng/mL。

2.4 验证试验

为了进一步验证响应面分析法的可靠性，采用上述最优条件培养菌株CXT11，实际测得OTA产量为7.427ng/mL，误差为2.22%，与未处理的菌株产OTA 6.087ng/mL相比升高了1.34ng/mL。因此，采用响应面分析优化得到的菌株CXT11产OTA的参数准确可靠。

3 结论

建立了以菌株CXT11的OTA产量为响应值，以葡萄糖质量浓度、SO2质量浓度和乙醇体积分数为因影响子的数学模型，由该模型得到各因素对真菌产OTA毒素影响大小顺序依次为葡萄糖质量浓度、乙醇体积分数、SO2质量浓度。产毒的最佳参数为葡萄糖质量浓度92.26g/L、SO2质量浓度8.26mg/L、乙醇体积分数0.05%。验证试验结果表明，OTA实际产量为7.427ng/mL，与未处理的菌株OTA产量6.087ng/mL相比升高了1.34ng/mL。

因此，在葡萄破碎后，即葡萄糖质量浓度较高、乙醇含量较低时，最有利于潜在产毒菌株产生OTA。添加一定量SO2能有效抑制其产毒，并且随着发酵的进行，乙醇含量的增加同样会抑制其产毒，为控制葡萄酒中OTA含量提供可行性方法。

[1]VARGAA J,KOZAKIEWICZB Z.Ochratoxin A in grapes and grape-derived products[J].Trends Food Sci Tech,2006,17(2):72-81.

[2]章英，许杨.谷物类食品中赭曲霉毒素A分析方法的研究进展[J].食品科学，2006，27（12）：767-771.

[3]ABRUNHOSA L,SERRA R,VENÂNCIO A.Biodegradation of ochratoxinAbyfungiisolatedfromgrapes[J].J Agr Food Chem,2002,50(25): 7493-7496.

[4]BATTILANI P,PIETRI A.Ochratoxin A in grape and wine[J].Eur J Plant Pathol,2002,108(7):639-643.

[5]赵博，丁晓文.赭曲霉毒素A污染及毒性研究进展[J].粮食与油脂，2006（4）：39-42.

[6]高翔，李梅，张立实.赭曲霉毒素A的毒性研究进展[J].国外医学卫生学分册，2005，32（1）：51-55.

[7]疏秀林，施庆珊，欧阳友生，等.赭曲霉毒素的产生及鉴别[J].中国卫生检验杂志，2008，18（10）：2183-2185.

[8]杨学威，段雪荣，卢新军，等.关于葡萄酒中赭曲霉素A的研究进展[J].中国酿造，2012，31（11）：12-14.

[9]褚庆华，郭德华，王敏，等.谷物和酒类中赭曲霉毒素A的测定[J].中国国境卫生检疫杂志，2006，29（2）：109-117.

[10]LASRAM S,BELLI N,CHEBIL S,et al.Occurrence of ochratoxigenic fungi and ochratoxin A in grapes from aTunisian vineyard[J].Int J Food Microbiol,2007,114(3):376-379.

[11]ZIMMERLI B,DICK R.Determination of ochratoxin A at the ppt level in human blood,serum,milk and some foodstuffs by high-performance liquid chromatography with enhanced fluorescence detection and immunoaffinity column cleanup:methodology and Swiss data[J].J Chromatogr B Biomed Sci Appl,1995,666(1):85-99.

[12]VARGA J,KOZAKIEWICZ Z.Ochratoxin A in grapes and grape-derived products[J].Trends Food Sci Technol,2006,17(2):72-81.

[13]European Commission.Commission Regulation(EC)No 123/2005 of 26 January 2005 amending regulation(EC)No 466/2001 as regards ochratoxin A[J].Off J Eur Union,2005,25:3-5.

[14]ASTORECA A,MAGNOLI C,BARBERIS C,et al.Ochratoxin A production in relation to ecophysiological factors byAspergillussection Nigristrains isolated from different substrates in Argentina[J].Sci Total Environ,2007,388(1):16-23.

[15]BELLÍN,A RAMOS J,SANCHIS V,et al.Incubation time and water activity effects on ochratoxin A production byAspergillussectionNigri strains isolated from grape[J].Lett Appl Microbiol,2004,38(1):72-77.

[16]PARDO E,MARÍN S,SANCHIS V,et al.Prediction of fungal growth and ochratoxin A production byAspergillus ochraceuson irradiated barley grain as influenced by temperature and water activity[J].Int J Food Microbiol,2004,95(1):79-88.

[17]LEONG S L,HOCKING A D,SCOTT E S.Effect of temperature and water activity on growth and ochratoxin A production by AustralianAspergillus carbonariusandA.nigerisolates on a simulated grape juice medium[J].Int J Food Microbiol,2006,110(3):209-216.

[18]ARROYO M,ALDRED D,MAGAN N.Environmental factors and weak organic acid interactions have differential effects on control of growth and ochratoxin A production byPenicillium verrucosumisolates in bread[J].Int J Food Microbiol,2005,98(3):223-231.

[19]RAO V K,RAMANA M V,GIRISHAM S,et al.Culture media and factors influencing ochratoxin a production by two species of penicillium isolatedfrompoultryfeeds[J].Natl Acad Sci Lett,2013,36(1):101-110.

[20]中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.SN/T1940—2007进出口食品中赭曲霉毒素A的测定方法[S].北京：中国标准出版社，2007.

Effect of different conditions on ochratoxin A production byAspergillus carbonarius

CHEN Lunjia,WANG Jing,HAN Shunyu*,SONG Rui,CHEN Kai
(College of Food Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

To understand the ochratoxin A(OTA)production byAspergillus carbonariusCXT11 isolated from the grape of Xinjiang province,the OTA content was determined by HPLC-fluorescence after cultured by rose bengal medium.On the basis of single factor experiment,response surface methodology was adopted to optimize the OTA production condition.The effect of different factors on OTA production in order was glucose concentration,ethanol content,SO2concentration.The optimum OTA production condition was obtained as follows:temperature 28℃,glucose concentration 92.26 g/L,SO2concentration 8.26 mg/L,ethanol 0.05%.Under this condition,the OTA production was 7.427 ng/ml.

ochratoxin A;Aspergillus carbonariusCXT11;toxin-producing conditions;response surface methodology

Q949.327.1

A

0254-5071（2014）04-0039-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.010

2014-02-18

甘肃省农业生物技术专项（GNSW-2013-16）

陈伦佳（1988-），男，硕士研究生，研究方向为葡萄酒中存在的真菌毒素。

*通讯作者：韩舜愈（1963-），男，教授，博士，研究方向为农产品贮藏加工及挥发性风味物质分析。