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芽孢杆菌混合发酵工艺条件的优化

时间:2024-07-28

何华美,李淑珍,陈丹霞,潘进权

(湛江师范学院生命科学与技术学院,广东湛江524048)

芽孢杆菌混合发酵工艺条件的优化

何华美,李淑珍,陈丹霞,潘进权*

(湛江师范学院生命科学与技术学院,广东湛江524048)

为提高饲料用芽孢杆菌中性蛋白酶的活力,考察了多种芽孢杆菌混菌发酵产蛋白酶的协同作用效果,并在单因素试验的基础上,采用响应面分析的中心组合试验设计对多芽孢杆菌的混合发酵工艺条件进行了优化。通过优化确定了混合发酵体系的最佳发酵条件为培养基最初pH值7.17,装液量50mL/250mL,接种量3%,发酵温度35.4℃,摇床转速200r/min,发酵周期100h。在优化的工艺条件下,芽孢杆菌混合发酵产蛋白酶的活力单位可达到2 986U/mL。

芽孢杆菌;混合发酵;蛋白酶;中心组合设计

已有大量研究显示,大多数芽孢杆菌属微生物由于能够分泌胞外淀粉酶和蛋白酶等消化酶,从而可以促进饲料消化,提高饲料利用率[1-2];芽孢杆菌属微生物可以在动物肠道定植,从而保持了动物肠道微生态的平衡,有效地抵御外来致病菌的致病作用,可以有效提高动物的抗病能力[3-4]。因此,近年来以枯草芽孢杆菌为代表的芽孢杆菌活菌制剂在养殖业中得到了越来越广泛的应用[5-6]。

随着各类芽孢在养殖业中不断被推广应用,以芽孢杆菌为代表的活菌制剂的生产规模不断扩大,芽孢杆菌类活菌制剂的清洁生产及活菌制剂发酵废液中活性物质,如蛋白酶[7-9]的综合利用已成为研究重点之一。然而,要实现活菌制剂发酵废液中蛋白酶的综合利用,提高发酵废液中蛋白酶浓度就尤为重要。大量的研究表明,不同芽孢杆菌之间可以存在良好的互惠共生关系[10],这种有益的共生关系可显著提高混合系统中各菌株的生长速率及代谢效率,从而在一定程度上提高某些产物的产量[11-13]。依据已有实验研究报道,本研究拟建立多种不同饲料用芽孢杆菌混合发酵体系,借助芽孢杆菌之间存在的良好共生关系,促进芽孢杆菌的生长,同时提高芽孢杆菌活菌制剂发酵废液中蛋白酶的活力单位,提升活菌制剂发酵废液的综合利用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

芽孢杆菌(Bacillus)A2、B2、B3菌株:湛江师范学院生命科学与技术学院发酵工程实验室分离保藏菌种。

斜面培养基:酵母粉5g,蛋白胨10g,NaCl5g,水1000mL,琼脂15g,pH 7.0~7.2。

种子培养基:酵母粉5g,蛋白胨10g,NaCl5g,水1000mL,pH 7.0~7.2。

发酵培养基:蔗糖40g,蛋白胨20g,K2HPO43g,麸皮30g,吐温80 1mL,CaCO33g,水1 000mL,pH 7.5。

氢氧化钠、碳酸钠、酒石酸钾钠、硫酸铜、钨酸钠、浓盐酸等均为分析纯:天津市科密欧化学试剂有限公司;牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA):上海阳光试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HYQ-60空气恒温振荡器:武汉汇诚生物科技有限公司;SPX-250B-2生化培养箱:上海博讯实业有限公司;723N可见分光光度计、FC104电子天平:上海精密科学仪器有限公司;3-18k冷冻离心机:美国Sigma公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化

将低温保存的芽孢杆菌A2、B1、B3菌株分别接种于斜面培养基,将其置于37℃的生化培养箱培养24h。

1.3.2 种子液的培养

在250mL三角瓶中装入种子培养基50mL,分别从试管斜面上挑取1环活化菌种,然后将其置于恒温摇床中37℃、150r/min培养24h。

1.3.3 发酵试验

将培养好的A2、B2、B3液体种子按照体积比2∶3∶3进行混合得到种子混合液。在250mL三角瓶中装入发酵培养基50mL,灭菌之后按照4%(v/v)的比例接种混合液体种子,然后将三角瓶置于恒温摇床中37℃、150r/min发酵72h。

1.3.4 粗酶液的分离与蛋白酶活性测定

将发酵72h后的培养液在4℃,8 000r/min的条件下离心10min,然后收集离心所得上清液,即为粗酶液,采用Folin-酚法测定其蛋白酶活性[14]。酶活定义:在试验条件下,每分钟水解酪蛋白释放出1μg当量酪氨酸所需酶量为1个酶活力单位。

1.3.5 发酵条件的单因素试验

培养基初始pH值对混合发酵产蛋白酶的影响:配制发酵培养基,分别调节其pH值至6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0,按照1.3.3的条件进行发酵试验并测定酶活,考察初始pH值对发酵产酶的影响。

发酵温度对混合发酵产酶的影响:配制发酵培养基,按照1.3.3的操作分别于27℃、32℃、37℃、42℃和47℃的温度下进行发酵试验并测定蛋白酶活力,考察温度对发酵产酶的影响。

接种量对混合发酵产酶的影响:配制发酵培养基,分别以1%、2%、3%、4%、5%和6%的接种量接种,按照1.3.3的操作进行发酵试验并测定蛋白酶活力,考察接种量对发酵产酶的影响。

摇床转速对混合发酵产酶的影响:配制发酵培养基,按照1.3.3的操作分别于50r/min、100r/min、150r/min、200r/min、250r/min的摇床转速条件下进行发酵试验并测定蛋白酶活力,考察摇床转速对发酵产酶的影响。

装液量对混合发酵产酶的影响:配制发酵培养基,在250mL三角瓶中分别装发酵培养基25mL、50mL、75mL、100mL和150mL,按照1.3.3的操作进行发酵试验并测定蛋白酶活力,考察装液量对发酵产酶的影响。

发酵时间对混合发酵产酶的影响:配制发酵培养基,按照1.3.3的操作进行发酵试验,分别发酵24h、48h、72h、96h、120h、144h后测定蛋白酶活力,考察发酵时间对发酵产酶的影响。

1.3.6 响应面分析

利用SAS统计软件,采用响应面分析法的中心组合试验设计[15],进一步考察单因素试验筛选出的显著影响因素,优化各因素的最佳取值,由此确定混合发酵的工艺条件。

2 结果与分析

2.1 培养基pH值对发酵产酶的影响

分别于不同pH条件下进行发酵试验考虑了培养基初始pH值对发酵产酶的影响,结果如图1所示。

图1 培养基初始pH对混合发酵产酶的影响Fig.1 Effect of initial pH on the protease yield by mixture-culture fermentation

由图1可知,培养基的起始pH对混合发酵产酶有较显著的影响,不同pH条件下的发酵产酶单位有明显差异;发酵培养基的起始pH值设定在7.5左右较为合适。

2.2 发酵温度对发酵产中性蛋白酶的影响

分别于不同的温度条件下进行发酵试验考察温度发酵产酶的影响,结果如图2所示。

图2 温度对混合发酵产酶的影响Fig.2 Effect of temperature on the protease yield by mixture-culture fermentation

由图2可知,发酵温度对混合发酵产酶有显著的影响;发酵温度过低(低于27℃)菌体生长非常缓慢进而影响酶的产量;发酵温度过高(超过40℃)易导致菌体过早衰老死亡,同时也会导致酶的稳定性降低而失活;由试验结果可初步确定混合发酵的适宜温度在37℃左右。

2.3 接种量对发酵产酶的影响

分别以不同的接种量进行发酵试验,考察了接种量对发酵产酶的影响,结果如图3所示。

图3 接种量对混合发酵产酶的影响Fig.3 Effect of inoculum on the protease yield by mixture-culture fermentation

由图3可知,接种量对混合发酵产酶也有一定的影响,过高或过低的接种量均会在一定程度上导致产酶量有所降低;混合发酵的适宜接种量在3%左右。

2.4 转速与装液量对发酵产酶的影响

图4 装液量(A)及摇床转速(B)对混合发酵产酶的影响Fig.4 Effect of broth content(A)and rotate speed(B)on the protease yield by mixture-culture fermentation

在摇瓶发酵的条件下,分别从250mL摇瓶装液量及摇床转速的角度考察了溶氧量对混合发酵产酶的影响,结果如图4所示。

由图4可知,芽孢杆菌混合发酵产酶量的高低受溶氧水平的显著影响。当摇瓶装液量过高(>50mL/250mL)或摇床转速过低(<150r/min),则蛋白酶的发酵产量会明显的降低。因此,要保证芽孢杆菌混合发酵产酶量的最大化,充足的氧气供应尤为重要。在摇床发酵条件下,最大装液量为50mL/250mL,摇床转速不宜低于200r/min。

2.5 发酵时间对发酵产酶的影响

考察了不同发酵周期芽孢杆菌混合发酵产蛋白酶的情况,结果如图5所示。

图5 发酵时间对混合发酵产酶的影响Fig.5 Effect of fermentation time on the protease yield by mixture-culture fermentation

由图5可知,芽孢杆菌在接种发酵24h后进入快速产酶期,蛋白酶的产率几乎与发酵时间成线性关系增长;与单一芽孢杆菌发酵产蛋白酶的情况相比[16-17],在混合发酵系统中芽孢杆菌发酵产酶的周期明显有所延长,可持续相对更长的发酵产酶时间,这应该是蛋白酶发酵产量得以提高的原因之一;发酵持续到96h后蛋白酶的产量趋于平稳,由此初步确定芽孢杆菌混合发酵的适宜时间为96h。

2.6 中心组合试验设计

通过以上单因素试验初步考察了各工艺参数对混合发酵产酶的影响情况,并在此基础上筛选出了对发酵产酶有显著影响并易于工艺放大的3个因素(培养基初始pH值、发酵时间和发酵温度)进行后续的响应面优化,同时固定其他因素取值:摇床转速为200r/min,接种量为3%,摇瓶装液量为50mL/250mL。表1、表2分别给出了中心组合设计的因素水平及试验设计与结果。

表1 中心组合设计因素与水平Table 1 Factors and levels of central composite design

表2 中心组合试验设计及结果Table 2 Design and results of central composite design

对表2的试验结果进行回归分析,可以拟合得到以下数学模型:

从表3可以看出,模型的P<0.05,表明该模型较显著;在因素水平的取值范围内,因素A、B、C的二次项对发酵结果的影响较显著,而单一因素项A、B、C及因素间的交互作用对发酵产酶的影响不显著。

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of the regression equation

图6给出了拟合模型的响应曲面。由图6可以看出,该曲面是典型的凸面响应,其上存在最大响应点。利用SAS软件分析确定了最大响应值为(2 909±177)U/mL,其对应的因素取值分别为发酵温度35.4℃,培养基初始pH值为7.17,发酵时间100h。4次重复试验结果为3 060U/mL、2 954U/mL、2 820U/mL、3 108U/mL,平均值为2 986U/mL,与模型的预测值基本一致,进一步验证了该模型的可靠性。

图6 各因素相互作用对混合发酵产酶影响的响应曲面及等高线Fig.6 Response surface plot and contour line of interaction among fermentation time,temperature,pH on the protease yield by mixture-culture fermentation

根据以上优化试验的结果,由此可确定芽孢杆菌混合发酵产蛋白酶的工艺条件:培养基初始pH值为7.17,装液量50mL/250mL,接种量3%,于35.4℃,摇床转速200r/min发酵100h。在此最佳条件下,芽孢杆菌混合发酵产蛋白酶的活力可达到2 986U/mL。

3 结论

本研究拟通过多种芽孢杆菌混合发酵的方式提高芽孢杆菌活菌制剂发酵废液中蛋白酶的活力单位,从而提高发酵废液的可利用性,实现活菌制剂发酵废液的综合利用及清洁生产。在构建了芽孢杆菌混合配伍体系的基础上,考察了发酵工艺条件,包括培养基pH值、发酵温度、时间、接种量、装液量及摇床转速对混合发酵产蛋白酶的影响,应用响应面分析的试验方法对工艺条件进行了优化,最终确立了适宜的芽孢杆菌混合发酵工艺条件:即培养基初始pH7.17,装液量50mL/250mL,接种量3%,于35.4℃,摇床转速200r/min发酵100h。在此最佳条件下,芽孢杆菌混合发酵产蛋白酶的活力可达到2 986U/mL。

构建的混合发酵体系使得发酵液中蛋白酶的活力有了显著的提高,远高于单一芽孢杆菌的蛋白酶酶活。试验结果表明,采用混合发酵的方式确实可显著提高活菌制剂发酵废液中蛋白酶的活力单位,在一定程度上提高了活菌制剂发酵废液的综合利用价值。

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Optimization of fermentation process by mixedBacillusstrains

HE Huamei,LI Shuzhen,CHEN Danxia,PAN Jinquan*
(School of Life Science and Technology,Zhanjiang Normal University,Zhanjiang 524048,China)

To increase the neutral protease activity fermented byBacillusstrains,the synergistic effect of multiple kinds ofBacillusstrains for preparing neutral protease by mixture-culture fermentation was investigated.On the basis of single factor experiment,the fermentation process by mixed Bacillusstrains was optimized through central composite design.After optimization,a proper mixture-culture fermentation process was determined: initial medium pH 7.17,liquid volume 50 ml in 250 ml flask,agitation speed of rotary shaker 200 r/min,inoculum 3%,temperature 35.4℃,fermentation time 100 h.Under these optimized conditions,the active unit of neutral protease produced byBacillusstrains by mixture-culture fermentation reached 2 986 U/ml.

Bacillusstrain;mixture-culture fermentation;protease;central composite design

Q939.97

A

0254-5071(2014)04-0056-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.014

2014-02-28

国家星火计划项目(2013GA780084);国家级大学生创新训练项目(201310579014)

何华美(1989-),女,本科生,研究方向为生物技术。

*通讯作者:潘进权(1978-),男,副教授,博士,研究方向为酶与发酵工程。

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