响应面分析法优化超声辅助提取红肉苹果花青苷工艺

窦玉慧，孙晓红，2，祝军，张玉刚，戴洪义*

（1.青岛农业大学园艺学院，山东青岛266109；2.青岛农业大学生命科学学院，山东青岛266109）

响应面分析法优化超声辅助提取红肉苹果花青苷工艺

窦玉慧1，孙晓红1，2，祝军1，张玉刚1，戴洪义1*

（1.青岛农业大学园艺学院，山东青岛266109；2.青岛农业大学生命科学学院，山东青岛266109）

采用响应面分析法优化超声波辅助提取红肉苹果花青苷的提取工艺。以花青苷的含量作为响应值，在单因素试验基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理采用4因素3水平的响应面分析法对各因素进行分析，结果表明，红肉苹果花青苷的最佳提取条件为丙酮体积分数80%，料液比1∶14（g∶mL），超声时间32min，盐酸含量1.2%，在此条件下提取的花青苷的质量浓度为7.01mg/100mL，与响应面预测理论值（7.09mg/100mL）相当。

红肉苹果；花青苷；工艺优化；响应面分析

花青苷是天然存在的最多的一类水溶性色素[1]，也是重要的植物次生代谢产物[2]。苹果果皮、果肉的颜色主要取决于花青苷的含量，而花青苷含量的多少不仅影响果实的商品特性也影响果实本身的营养价值[3]。花青苷属于黄酮类化合物[4]，具有很强的抗氧化能力，在预防与生活方式息息相关的疾病（如癌症、糖尿病和心血管病等）方面发挥着重要作用[5]。如今人们对一些天然的有色作物的兴趣迅速的增加[6]，因此人们对色彩丰富的水果蔬菜及其加工品需求的增加。新疆有很长的栽培红肉苹果历史且具有大量的红肉苹果资源。‘红勋一号’是原产于新疆的一个新的红肉苹果[（Malus sieversii f.neidzwetzkyana）（Dieck）Langenfnative]品种[7]，其花青苷含量丰富。矢车菊素是苹果中最常见的花青素，3-葡萄糖苷是花青素中最活跃的抗氧化剂的形式[8]。充分利用‘红勋一号’红肉苹果中的花青苷对于当地的种植业以及加工企业都将产生巨大的经济效益。而目前多数关于花青苷的定量、纯化、分离都依赖于昂贵的设备或是复杂的样品准备[9]。因此选择一种简便、快捷的提取工艺具有重要的意义。

超声波辅助技术[10]作为一种先进的提取方法具有操作简便快捷、提取温度低、提取率高、提取物的结构不被破坏等特点，结合响应面分析法（response surface methodology，RSM）[11]得到红肉苹果花青苷提取的最佳工艺条件。RSM是一种有效的生物统计方法，且目前已广泛应用于农业及生物研究等方面[12-14]，许多研究表明该方法对于一些流程的开发、改进、优化作用巨大[15-16]。本试验利用RSM来研究各因素超声时间、溶剂浓度、溶剂中酸含量和料液比对红肉苹果花青苷提取的效率的影响，最终得到红肉苹果花青苷超声波辅助提取的最佳条件，为以后的科研以及加工生产提供一种高效的提取方式。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘洪勋1号’红肉苹果于2013年9月15日摘自青岛农业大学胶州农场，清洗干净，室温条件下风干，移除果柄及果核，将果肉果皮分离且切成碎块后分别置于-70℃液氮中迅速冷冻后用料理机将其粉碎成粉末后置于-80℃冰箱中存储。

甲醇、乙醇、丙酮、盐酸、氯化钾和结晶乙酸钠均为分析纯：天津市巴斯夫化工有限公司。

1.2 仪器设备

HP2500型超声波清洗器：保定圣峰仪器科技有限公司；SHB-III S循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；AR2140电子天平、Ultrospec 3300紫外分光光度计：安玛西亚（中国）有限公司；JYL-350料理机：山东九阳小家电有限公司；S20K梅特勒-托利多pH计：上海雷磁创益仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 ‘洪勋1号’红肉苹果花青苷的提取

在传统提取方法的基础上有些改动[17]：精确称取1.0g‘洪勋1号’红肉苹果粉末于20mL试管中，按试验设计要求加入相应的溶剂，在室温条件下超声一段时间，用布氏漏斗减压抽滤得到花青苷提取液。

1.3.2 ‘洪勋1号’红肉苹果花青苷的测定

其含量测定采用pH示差法[18]。依据pH示差法的原理取0.025mol/L（pH1.0）的氯化钾缓冲液和0.4mol/L（pH4.5）的乙酸钠缓冲液各5mL分别加入1mL的待测样品，混匀，室温下避光平衡30min，用蒸馏水作空白，在矢车菊素-3-葡萄糖苷最大吸收波长510nm和700nm（校正浑浊度）处，测定吸光度值，稀释样品的吸光度值以及原始样品中花青苷质量浓度按如下公式计算：

式中：MW为矢车菊素-3-葡萄糖苷分子质量，449.2；DF为稀释因子；ξ为矢车菊素-3-葡萄糖苷的消光系数，26 900；1为光程，cm。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取溶剂种类及体积分数的确定

由于花青苷是极性化合物易溶于甲醇、乙醇、丙酮、水等极性溶剂[19]，选用甲醇、乙醇和丙酮作为提取剂。精确称取1.0g果肉粉末63份，分别以不同体积分数的甲醇、乙醇、丙酮（含0.1%盐酸）溶液按料液比1∶10（g∶mL），超声辅助（室温）提取30min，用分光光度计测定花青苷含量，每个梯度设平行试验3次，考察不同提取溶剂对红肉苹果花青苷提取的影响，结果见图1。

由图1可知，随着溶剂体积分数的增加，乙醇、丙酮的提取效果均呈现先增加后减少的变化趋势，而甲醇随着提取液体积分数的增加花青苷的含量增加。但各体积分数变化条件下丙酮盐酸水溶液的提取效果明显优于乙醇、甲醇，且在丙酮体积分数为80%时提取效果最好，故选用丙酮（含0.1%盐酸）溶液作为红肉苹果花青苷提取的溶剂。

图1 不同体积分数提取液对花青苷提取量的影响Fig.1 Effect of different volume fraction solvents on anthocyanin extraction from red-flesh apple

2.1.2 料液比的确定

精确称取1.0g果粉24份，每个梯度重复试验3次，分别按料液比1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16、1∶18、1∶20（g∶mL）用体积分数为80%丙酮（含0.1%盐酸）溶液在室温下超声辅助提取30min，考察不同料液比对红肉苹果花青苷提取的影响，结果见图2。

图2 料液比对花青苷提取量的影响Fig.2 Effect of different solid-liquid ratio on anthocyanin extraction from red-flesh apple

由图2可知，随着料液比的增加花青苷的提取量逐渐增加，但当料液比达到1∶14（g∶mL）时花青苷的提取量达到最大，说明果粉中的花青苷已经充分的提取出来了，再增加料液比花青苷的提取量反而会有减小的趋势，而且还不利用提取成本的节约。

2.1.3 提取时间的确定

精确称取1.0g果粉24份，每个梯度重复试验3次，用体积分数为80%的丙酮（含0.1%盐酸）溶液按料液比1∶14（g∶mL）在室温下超声辅助提取8min、16min、24min、32min、40min、48min、56min、64min，考察不同提取时间对红肉苹果花青苷提取的影响，结果见图3。

图3 超声时间对花青苷提取量的影响Fig.3 Effect of different extraction time on anthocyanin extraction from red-flesh apple

由图3可知，随着超声时间的延长，花青苷的提取越来越充分即提取量增大，当超声时间为32min时红肉苹果花青苷提取量达到最大，之后随着超声时间的延长，花青苷的提取量降低，可能是由于花青苷结构的不稳定性，随着超声时间的延长使部分花青苷降解。

2.1.4 盐酸含量的确定

精确称取1.0g果肉粉末24份，在体积分数为80%的丙酮溶液中分别加入0.05%、0.35%、0.65%、0.95%、1.25%、1.55%、1.85%、2.15%的盐酸溶液，按料液比1∶14（g∶mL）室温下超声辅助提取32min，考察不同盐酸添加量对红肉苹果花青苷提取的影响，结果见图4。

图4 盐酸含量对花青苷提取量的影响Fig.4 Effect of different HCl concentration on anthocyanin extraction from red flesh apple

由图4可知，随着盐酸含量的增加花青苷的提取量逐渐增加，当盐酸含量为1.25%时花青苷的提取量最高，之后随着盐酸含量的继续增加，花青苷的提取量急剧减少，可能由于随着盐酸含量的增加，花青苷的稳定性降低，部分氧化降解。

2.2 提取工艺的优化

2.2.1 试验因素及水平的选取

选取对花青苷的提取影响较大的丙酮体积分数、料液比、超声时间、盐酸含量4个因素，以提取的花青苷含量作为响应值。根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，在上述单因素试验的的基础上利用Design Expert 8.0.7.01进行4因素3水平的响应面试验设计，其中中心点试验重复5次，试验因素及水平见表1。

表1 超声辅助提取红肉苹果的响应面分析因素及水平Table 1 Coded values of corresponding actual values of independent variables in response surface design

表2 超声波辅助提取红肉苹果的响应面试验设计及结果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding expreimental data

响应面优化法即响应曲面法[20]，该法通过对过程的回归拟合和响应曲面等高线等的绘制，求出响应与各因素、水平的响应值。利用Design Expert 8.0.7.1对表2中数据进行回归分析得到其影响因素的一次效应、二次效应以及两两因素间交互作用的二元多次回归方程：

2.2.2 回归模型的方差分析

从表3可知，各因素对响应值（花青苷提取量）影响大小的顺序依次为：酸量>丙酮体积分数>料液比>提取时间（根据F值的大小），此模型达到极显著水平（P<0.000 1），失拟项各项分析表明该模型失拟不显著（P>0.05）。决定系数R=0.962 3，表明90%以上的该类试验可用该模型解释，但并不是R值越大越好[21]，从表3中还可以得知该模型的一次项X1、X4和二次项X12、X22、X32、X42对响应值（花青苷提取量）的影响显著。

2.2.3 响应面曲面分析

图5 各因素交互作用对花青苷提取量影响的响应面及等高线Fig.5 Response surface plot and contour line of the pairwise interactive effects of four extraction conditions on extraction concentration of anthocyanin from red-flesh apple

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

RSM方法的图形是特定的响应值（Y）与对应的因素X1、X2、X3、X4构成的一个三维空间在二维平面上的等高图，每个响应面对其中的两个因素进行分析，另外两个因素固定在零水平。从中可以直观的反应各因素对响应值的影响，从试验所得的响应面分析图上可以找到其在提取过程中的相互作用[16]。相应曲面比较陡，说明此时各因素对响应值的影响较为显著，反之，则各因素对响应值的影响较小。而等高线密度大，则影响因素对响应值贡献就大，反之亦然[17]。

图5直观的反应了对响应值花青苷含量影响的大小。由图5可知，A因素丙酮体积分数和D因素对响应值花青苷的浓度的影响较为显著，表现为响应面的坡度较陡，等高线呈现椭圆形且等高线的密度较大，另从等高线图可知其A丙酮体积分数与C超声时间和B料液比与超声时间的交互作用不强，即对响应值的影响不大，表现为等高线呈现圆形。

根据所得模型及以上的响应面分析可以预测超声波辅助提取‘洪勋1号’红肉苹果花青苷提取的最佳工艺条件为室温下丙酮体积分数78.94%，料液比13.91（g∶mL），超声时间31.77min，盐酸含量1.21%，在此条件下，红肉苹果花青苷含量理论值为7.09mg/100mL。

2.2.4 试验结果的验证

为了验证上述模拟试验结果的准确与否，对其进行验证试验（n=3），考虑到实际操作的方便在室温下，丙酮体积分数取80%，料液比取1∶14（g∶mL），超声时间32min，盐酸含量取1.2%条件下所得红肉苹果花青苷含量为7.01mg/100mL，且平行试验的重复性较好，与理论预测值红肉苹果花青苷含量7.09mg/100mL无显著差异（P＞0.05）。所以采用Box-Behnken中心组合试验设计结合响应面分析法得到的花青苷的工艺条件可靠。

3 结论

采用超声辅助提取技术，根据Box-Benhnken中心组合的试验设计原理，结合响应面分析法确定了室温下‘洪勋1号’红肉苹果花青苷提取的最佳工艺条件为丙酮体积分数80%，料液1∶14（g∶mL），超声时间32min，盐酸含量1.2%，在该条件下提取的花青苷含量为7.01mg/100mL，并得到以提取的花青苷含量作为因变量与各处理因素作为自变量的二次多元回归模型，该模型及显著对试验拟合较好，具有一定的指导意义。

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Optimization of ultrasonic-assisted solvent extraction of anthocyanin from red-flesh apple by response surface methodology

DOU Yuhui1,SUN Xiaohong1,2,ZHU Jun1,ZHANG Yugang1,DAI Hongyi1*
(1.College of Horticulture,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China; 2.College of Life Science,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China)

Response surface methodology was used to optimize the process for the solvent extraction of anthocyanin from red-flesh apple with ultrasonic assistance.Taking cyanine glucoside content as response value,on the basis of single factor experiment,Box-Behnken central composite design and four factors three levels response surface analysis theory to optimize the anthocyanin extraction process.Result showed that the optimum conditions for anthocyanin extraction were determined as follows:acetone concentration 80%,solid-liquid ratio 1∶14(g/ml),extraction time 32 min,and acid concentration 1.2%.Under such condition,the concentration of anthocyanin was 7.01 mg/100 ml,close to the predicted value 7.09 mg/100 ml.

red-flesh apple;anthocyanin;process optimization;response surface methodology

S661.1

A

0254-5071（2014）04-0065-05

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.016

2014-03-11

国家现代苹果产业技术体系项目（CARS-28-01-07）

窦玉慧（1989-），女，硕士研究生，研究方向为果树育种与生物技术。*

戴洪义（1956-），男，教授，硕士，研究方向为果树育中与生物技术。