枯草芽孢杆菌GXA-28发酵生产γ-聚谷氨酸动力学研究

王青龙，陈桂光，曾伟，郑双凤，唐真，粱智群

（广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530004）

枯草芽孢杆菌GXA-28发酵生产γ-聚谷氨酸动力学研究

王青龙，陈桂光，曾伟，郑双凤，唐真，粱智群*

（广西大学生命科学与技术学院，广西南宁530004）

对耐热高产菌株枯草芽孢杆菌GXA-28分批发酵生产γ-聚谷氨酸的动力学特征进行了研究，基于菌体生长特性，结合Logistic方程和Luedeking-Piret方程，提出了菌体生长、产物合成、葡萄糖消耗以及谷氨酸钠消耗的动力学模型。应用Origin8.5对数据进行分析处理，得到了Bacillis subtilisGXA-28分批发酵合成γ-聚谷氨酸相应的动力学参数。将模型预测值和实验值进行比较，结果表明，模型基本反映了枯草芽孢杆菌GXA-28分批发酵过程中的动力学特征。

枯草芽孢杆菌GXA-28；γ-聚谷氨酸；动力学模型

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）主要是自然界中微生物来源的一种强水溶性的多聚氨基酸高分子化合物[1]。其具有良好的生物可降解性、可食用性、生物相容性和保湿性[2]，对人体和环境无毒无公害，可广泛用于工业、农业、医药、食品、环境保护等[3]，还可应用于化妆品、食品用水凝胶[4]、黏稠剂[5]、土壤沙地的蓄水保水剂[6]、高吸水剂[7-8]、高强度纤维的制备以及生物医学等领域[9]。近年来，随着国内外对γ-聚谷氨酸研究的深入，γ-聚谷氨酸作为一种可降解高分子化合物，越来越显现出其广阔的科研价值和应用前景。目前由于受到发酵工艺、生产成本及生产菌株的限制，国内尚未见大规模生产的相关报道，因此对聚谷氨酸发酵过程的研究就有了很重要的现实意义。

国内目前主要是将菌种选育以及对发酵条件的优化作为研究重点，有关发酵动力学模型的报道相对较少[10]。本实验考察了γ-PGA分批发酵过程中的菌体生长、产物合成、底物消耗情况。运用Origin 8.5数据处理软件对枯草芽孢杆菌GXA-28发酵动力学模型进行非线性拟合，并获得了相应的动力学模型及模型参数。利用拟合方程可以预测分批发酵过程中菌体量、γ-PGA量、葡萄糖量、谷氨酸钠量的变化情况，为下一步的放大培养及补料分批发酵等提供了基础数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

枯草芽孢杆菌GXA-28（B.subtilisGXA-28）：生命科学与技术学院自主筛选，菌株保藏编号CCTCC M2012347。

葡萄糖：天津市科密欧化学试剂有限公司；谷氨酸钠（纯度≥99%）：南宁市荷花味精有限公司；酵母膏：北京奥博星生物技术有限公司；KH2PO4：天津市红岩化学试剂厂；MgSO4：天津博迪化工股份有限公司。

种子液培养基：葡萄糖10g/L、酵母膏5g/L、谷氨酸钠5g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO40.1g/L，pH 6.5±0.1。

发酵培养基：葡萄糖30g/L、酵母膏2.5g/L、谷氨酸钠20g/L、KH2PO40.5g/L、MgSO40.1g/L，pH 6.5±0.1。

1.2 仪器与设备

YP1200型电子天平：上海精科实业有限公司；HVE-50自动灭菌锅：日本HIRAYAMA公司；SPX-250型生化培养箱：上海跃进医疗仪器厂；EBA21型高速离心机：德祥科技有限公司；SBA-40D生物传感分析仪：山东省科学院生物研究所；UV-1800紫外分光光度计：日本SHIMADIU公司；SKY-211B恒温培养振荡器：上海苏坤实业有限公司。

1.3 方法

1.3.1 种子培养液的制备

取一管甘油保藏菌种接入装有30mL种子培养基的250mL三角瓶中，于42℃、160r/min条件下培养16h，得到种子培养液。

1.3.2 分批发酵培养

将培养得到的种子培养液取1mL接种于装有50mL发酵培养基的三角瓶中，于42℃、160r/min条件下恒温振荡培养。考察不同时间段培养液中的菌体生长、产物合成、底物消耗情况。

1.3.3 残糖、残谷氨酸钠含量测定

由上述培养条件获得的发酵液采用生物传感分析仪测定性能指标，温度10～35℃，相对湿度＜90%，可同时测定β-D-葡萄糖、L-谷氨酸含量，测定范围：0～100mg/100mL。

1.3.4 聚γ-谷氨酸产量的测定

按照参考文献[11]的方法测定。

1.3.5 枯草芽孢杆菌GXA-28生物量的测定

发酵液稀释10倍后，用可见分光光度计于波长660nm处测定其吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 动力学模型的建立

2.1.1 菌体生长动力学模型的建立

描述菌体生长的动力学模型最常用的有Monod方程和Logistic方程，Monod方程主要用来描述理想化的均衡生长动力学模型。Logistic方程[12]与Monod方程相比，其限制因子主要是菌体浓度或生长空间，而γ-PGA分批发酵过程后期发酵液黏度较大，因此菌体生长将受到生长空间及氧传质等因素的限制，选用Monod方程进行建模会导致结果有较大偏差，因此本实验选用Logistic方程对菌体生长规律进行描述。Logistic方程为：

式中：X为菌体生物量（用OD660nm值表示）；μm为最大比生长速率，h-1；Xmax为菌体最大生物量（用OD660nm值表示）。

将上式对时间t积分，得到Logistic方程的积分形式

式中：X0为菌体初始生物量（用OD660nm值表示）；μm为最大比生长速率，h-1；Xmax为菌体最大生物量（用OD660nm值表示）；t为时间，h。

2.1.2 产物合成动力学模型建立

通过跟踪取样分析发现，枯草芽孢杆菌GXA-28分批发酵生产γ-PGA分为2个阶段：第一个阶段主要是菌体快速的生长，产物合成量较少，此时基质的消耗主要用于菌体的生长；第二阶段时γ-PGA开始快速合成，在此过程中菌体量已经接近稳定值，此时基质的消耗主要用于γ-PGA的合成。由此可以明显看出，微生物发酵法生产γ-PGA属于部分偶联型[13]。因此本实验选用由Luedeking和Piret提出的Luedeking-Piret方程对γ-PGA的合成规律进行描述如下：

将上式简化得

式中：α，β为动力学模型参数；X为菌体生物量（用OD660nm值表示）；μm为最大比生长速率，h-1；Xmax为菌体最大生物量（用OD660nm值表示）；dP/dt为γ-聚谷氨酸产物合成速率，g（/L·h）。

将上式积分得

式中：P为γ-聚谷氨酸产量，g/L；α，β为动力学模型参数；X0为菌体初始生物量（用OD660nm值表示）；μm为最大比生长速率，h-1；Xmax为菌体最大生物量（用OD660nm值表示）；t为时间，h。

2.1.3 葡萄糖消耗动力学模型的建立

葡萄糖在聚谷氨酸发酵过程中是细胞生长和产物合成所需的重要营养成分，其消耗主要用于3个方面：①生成新的细胞；②用来维持细胞基本生命活动；③是γ-PGA的合成。因此葡萄糖消耗动力学可以用如下方程描述

式中：YX/S为葡萄糖用于菌体生长的得率常数，g/g；YP/S为葡萄糖用于产物积累的得率常数，g/g；mx为微生物的维持常数，g/（L·h）；X为菌体生物量（用OD660nm值表示）；dS1/dt为葡萄糖消耗速率，g/（L·h）。

在分批发酵过程中，菌体呼吸消耗的基质可以认为是菌体生长消耗的一部分[14-15]，因此葡萄糖的消耗就可以简单的分为菌体生长的消耗和产物合成的消耗两部分。故葡萄糖消耗的动力学模型可以简化为

式中：k1为葡萄糖用于菌体生长的得率常数，g/g；k2为葡萄糖用于产物积累的得率常数，g/g。将（1）、（3）式子带入得

式中：k1为葡萄糖用于菌体生长的得率常数，g/g；k2为葡萄糖

用于产物积累的得率常数，g/g；X为菌体生物量（用OD660nm值表示）；Xmax为菌体最大生物量（用OD660nm值表示）；α，β为动力学模型参数；μm为最大比生长速率，h-1。

将（8）式子积分得

式中：S1为葡萄糖的质量浓度，g/L；S0为葡萄糖初始质量浓度，g/L；X0为菌体初始生物量（用OD660nm值表示）；k1为葡萄糖用于菌体生长的得率常数，g/g；k2为葡萄糖用于产物积累的得率常数，g/g；Xmax为菌体最大生物量（用OD660nm值表示）；α，β为动力学模型参数；μm为最大比生长速率，h-1。

2.1.4 谷氨酸钠消耗动力学模型的建立

枯草芽孢杆菌GXA-28属于底物依赖型菌株，因此谷氨酸纳的消耗主要用于γ-PGA的合成，谷氨酸钠消耗的动力学模型可以简化为：

式中：dS2/dt为谷氨酸钠消耗速率，g/（L·h）；k3为谷氨酸钠用于产物合成的得率常数，g/g。

对上式积分得

式中：S2为谷氨酸钠质量浓度，g/L；S0为葡萄糖初始质量浓度，g/L；X0为菌体初始生物量（用OD660nm值表示）；k3为谷氨酸钠用于产物合成的得率常数，g/g；Xmax为菌体最大生物量（用OD660nm值表示）；α为动力学模型参数；μm为最大比生长速率，h-1。

2.2 动力学模型参数求解

根据实验数据和上述的模型方程应用Origin 8.5软件对实验值进行非线性拟合，获得最优化参数估计值。并得出实验值与预测值之间的方差，分别为菌体生长动力学模型R2=0.997，产物合成动力学模型R2=0.993，葡萄糖消耗动力学模型R2=0.991，底物谷氨酸钠模型R2=0.989。参数估计值结果见表1。

表1 分批发酵生产γ-PGA的动力学参数估计值Table 1 Estimated kinetic parameter of γ-PGA batch fermentation

将拟合所得模型参数代入方程可以得出γ-PGA分批发酵的动力学模型分别为：

菌体生长的动力学模型

产物γ-PGA合成的动力学模型

葡萄糖消耗的动力学模型

谷氨酸钠消耗的动力学模型

2.3 曲线拟合分析

为了验证上述动力学模型的可靠性，本实验运用Origin 8.5数据处理软件对γ-PGA分批发酵过程进行非线性拟合分析，得到了γ-PGA分批发酵过程中菌体生长、产物合成、葡萄糖消耗以及谷氨酸钠消耗的拟合曲线分别如图1～图4所示。从图1～图4可以看出，除了在发酵开始阶段和结束阶段的个别点的相对误差较大外，在发酵中期，所建动力学模型都能对真实的发酵情况进行很好的拟合。可以认为拟合曲线基本反映了γ-PGA真实的发酵过程。

图1 菌体生物量实验值与拟合曲线的比较Fig.1 Comparison of fitted curve and measured biomass

图2 γ-PGA产量实验值与拟合曲线的比较Fig.2 Comparison of fitted curve and measured γ-PGA yield

图3 剩余葡萄糖量实验值与拟合曲线比较Fig.3 Comparison of fitted curve and measured remaining glucose content

图4 谷氨酸钠剩余量实验值与拟合曲线比较Fig.4 Comparison of fitted curve and measured sodium glutamate content

3 结论

通过对枯草芽孢杆菌GXA-28发酵合成γ-PGA特征分析，运用Origin 8.5数据处理软件进行非线性拟合，得出其分批发酵过程中菌体生长、γ-PGA合成、葡萄糖消耗、底物消耗的动力学模型及相关参数，通过拟合曲线图可以看出，实验值与模型曲线非常接近。将预测值与实验值进行对比可以看出，除发酵初期和发酵末期的个别点相对误差较大外，在发酵中期动力学模型能很好的对实验数据进行拟合。因此可以用该模型来预测发酵液中菌体量、产物合成量、葡萄糖以及谷氨酸钠在发酵过程的变化情况，为以后工业化生产提供理论依据及补料分批发酵提供参考。

[1]赵紫华，马霞，刘蕊，等.高产γ-聚谷氨酸菌株的选育与鉴定[J].中国酿造，2007，26（7）：32-34.

[2]SHIH I L,VAN Y T.The production of poly-(γ-glutamic acid)from microorganisms and its various applications[J].Bioresource Technol, 2001,79(3):207-225.

[3]ASHIUCHI M.Occurrence and biosynthetic mechanism of poly-gamma-glutamic acid[M]//HAMANO Y.Amino-acid homopolymers occurring in nature.Berlin,Springer Berlin Heidelberg,2010:77-93.

[4]KONNO A,TAGUCHI T,YAMAGUCHI T.Bakery products an noodles containing poly glutamic acid:US,4888193[P].1989-11-19.

[5]YAHATA K,SADANOBU J,ENDO T.Preparation of poly-benz-γ-glutamic acid fiber[J].Polym Prepr Jpn,1992,42:1077-1082.

[6]CHOI H J,KUNIOKA M.Preparation conditions and swelling equilibria of hydrogel prepared byγ-irradiation from microbial poly(γ-glutamic acid)[J].Radiat Phys Chem,1995,46(2):175-179.

[7]BORBELY M,NAGASAKI Y,BORBELY J,et al.Biosynthesis and chemical modification of poly(γ-glutamic acid)[J].Polym Bull,1994, 32(2):127-132.

[8]KUNIOKA M,FURUSAWA K.Poly(γ-glutamic acid)hydrog prepared from microbial poly(γ-glutamic acid)acid alkaced amine with watersoluble carnodiimide[J].J Appl Polym Sci,1997,65(10):1889-1896.

[9]YASUYOSHI A,YUJI F,SHUICHI K.Health food with poly(γ-glutamic acid)as the chief ingredient:Japan,5095767A2[P].1993-04-20.

[10]任尚美，王晓丽，马霞，等.枯草芽孢杆菌发酵生产γ-聚谷氨酸的动力学研究[J].中国酿造，2008，27（21）：59-62.

[11]ZENG W,CHEN G G,ZHANG Y K,et al.Studies on the UV spectrum of poly（γ-glutamic acid）based on development of a simple quantitative method[J].Int J Biol Macromol,2012,51(1):83-90.

[12]王济川，郭志刚.Logistic回归模型—方法与应用[M].北京：高等教育出版社，2001.

[13]聂光宇.枯草芽孢杆菌生产γ-聚谷氨酸的培养条件及动力学研究[D].杭州：浙江大学硕士论文，2006.

[14]STEFAN S,KHOLODENKO B N,WESTERHOFF H V.Cellular information transfer regarded from a stoichiometry and control analysis perspective[J].Biosystems,2000,55(1-3):73-78.

[15]GIUSEPPIN M L,VAN RIEL N A.Metabolic modelin ofSaccharomyces cerevisiaeusing the optimal control of homestasis:a cybernetic model definition[J].Metab Eng,2000,2(1):14-21.

Fermentation kinetics model of γ-polyglutamic acid production byBacillis subtilisGXA-28

WANG Qinglong,CHEN Guiguang,ZENG Wei,ZHENG Shuangfeng,TANG Zhen,LIANG Zhiqun*
(College of Life Science and Technology,Guangxi University,Nanning 530004,China)

The kinetics feature of a heat-resistant and high-yieldγ-polyglutamic acid strainBacillis subtilisGXA-28 was investigated.Based on bacterial growth characteristics,combining with Logistic and Luedeking-Piret equation,the kinetic model of microbial growth,γ-polyglutamic acid formation and glucose consumption during fermentation were proposed.The data was analyzed with origin 8.5 to generate the kinetics parameters ofγ-ploy glutamic acid production byB.subtilisGXA-28 batch fermentation.The prediction value was compared with the experimental value;it showed that the model could provide reasonable description for the batch fermentation process ofB.subtilisGXA-28.

Bacillis subtilisGXA-28;γ-polyglutamic acid;kinetics model

Q936

A

0254-5071（2014）04-0075-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.018

2014-03-13

广西研究生教育创新计划资助项目（YCBZ2012004）；2013年广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室研究课题；2013年广西大学微生物及植物遗传工程教育部重点实验室主任基金课题

王青龙（1988-），男，硕士研究生，研究方向为发酵工程及生物制药。

*通讯作者：梁智群（1959-），男，教授，博士，研究方向为生物工程学。