高收率低苦味值大豆低聚肽的制备

谷宇，刘艳，涂钰，芦明春*

（1.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034；2.江苏三仪科研质量控制中心，江苏邳州221300）

高收率低苦味值大豆低聚肽的制备

谷宇1，刘艳2，涂钰1，芦明春1*

（1.大连工业大学食品学院，辽宁大连116034；2.江苏三仪科研质量控制中心，江苏邳州221300）

以大豆分离蛋白为原料，以酶解收率为指标对最优的酶解工艺进行研究。在单酶水解的基础上，用复合碱性蛋白酶，中性蛋白酶，胰蛋白酶进行水解，通过正交试验确定了复合酶的最佳水解条件为：碱性蛋白酶/中性蛋白酶/胰蛋白酶加酶1∶2∶3，温度50℃，酶解时间4.5h，在此最佳条件下，酶解收率为86.76%，大豆低聚肽含量为93.49%，苦味值比单酶水解明显降低。

大豆低聚肽；酶解收率；苦味值

大豆低聚肽是指大豆分离蛋白经过酶解、分离、脱色、脱盐、超滤、浓缩、喷雾干燥等工艺精制而成的肽混合物，主要由3～6个氨基酸残基组成的低肽混合物，还含有少量大分子肽、游离氨基酸等成分[1-3]。与传统大豆蛋白相比，大豆低聚肽具有酸溶特性、乳化性、热稳定性、高流动性和高吸水性等优良的理化性质[4-6]。另一方面，大豆低聚肽还具有独特的生理功能，如低抗原性、阻止胆固醇水平升高、降压、恢复疲劳、抗氧化、减肥等[7-9]。目前，大豆低聚肽的制备单酶水解法较为常见，酶解法的反应条件温和，过程容易控制，而且对氨基酸的破坏小[10]。此法简单易行，但存在水解液较苦，水解度不高等问题[11]。有文献报导，多酶复合水解的水解收率要显著高于单酶水解收率[12]。大豆低聚肽分子质量的检测耗时耗力成本高，在不必要时可以用三氯乙酸法（trichloroacetic acid，TCA）代替，高分子蛋白质在酸性条件下易被沉淀，相对分子质量较小的蛋白质水解物（酸溶蛋白）可溶于酸性溶液（其中包含肽及游离氨基酸）。样品经酸化后，滤液中的酸溶蛋白含量减去游离氨基酸含量即为肽含量[13]。

本研究主要对复合酶酶解大豆分离蛋白（soy protein isolate，SPI）工艺以及降低苦味值的条件进行研究。为生产收率更高、苦味更低的大豆低聚肽提供理论基础，进一步扩展大豆低聚肽在食品中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆分离蛋白：山东御馨蛋白有限公司；碱性蛋白酶：河南仰韶生化工程有限公司；中性蛋白酶：南宁东恒华道生物科技有限公司；胰蛋白酶、盐酸、氢氧化钠、硫酸、硫酸铜、硫酸钾、硼酸、三氯乙酸、甲醛等均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

SH220石墨消解仪、K9840型自动凯氏定氮仪：济南海能仪器有限公司；80-3大容量离心机、JJ-1定时电动搅拌器、85-1恒温磁力搅拌器：江苏金坛市中大仪器厂；DK-B824电热恒温水浴锅：上海精宏实验设备有限公司；UB-7pH计：丹佛仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酶解方法

将大豆分离蛋白按照固液比1∶25加水搅拌，在温度75℃，pH9.0，时间10min的条件下进行预处理，调至酶解温度、酶解pH值，加酶酶解一定时间，沸水浴灭酶15min，5 500r/min条件下离心10min，取上清液，量取上清液体积，测定蛋白含量、游离氨基酸含量、苦味值等。

1.3.2 蛋白质含量测定方法

采用凯氏定氮法测定。

1.3.3 酸溶蛋白含量的测定

根据GB/T 22492—2008《大豆肽粉》中方法测定。

1.3.4 游离氨基酸含量的测定

根据GB/T5009.39—2003《酱油卫生标准的分析方法》中方法测定。

1.3.5 大豆低聚肽含量计算

大豆低聚肽含量=酸溶蛋白含量-游离氨基酸含量

1.3.6 苦味评价方法

称取盐酸奎宁0.1g溶于100mL体积分数95%的乙醇溶液中，取10mL用水稀释至100mL，配成质量浓度1.0×10-4g/mL的盐酸奎宁溶液，再分别稀释到9.0×10-5g/mL、8.0×10-5g/mL、7.0×10-5g/mL、6.0×10-5g/mL、5.0×10-5g/mL、4.0×10-5g/mL、3.0×10-5g/mL、2.0×10-5g/mL、1.0×10-5g/mL，其苦味值分别定为10～1。通过品尝方法将大豆分离蛋白的酶解液与不同浓度的盐酸奎宁比较，确定苦味值[6]。

1.3.7 酶解收率计算

1.3.8 最佳酶解工艺的确定

酶解收率为指标，进行单酶试验，在单酶试验的基础上，根据碱性蛋白酶，中性蛋白酶，胰蛋白酶最优水解条件，进行3种酶复合酶解。以加酶比例（碱性蛋白酶/中性蛋白酶/胰蛋白酶），酶解温度，酶解pH值，酶解时间为试验因素，进行正交试验优化复合酶水解大豆分离蛋白条件，酶解条件优化正交试验因素水平见表1。

表1 大豆分离蛋白酶解条件优化正交试验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for soy protein isolate hydrolysis condition optimization

2 结果与分析

2.1 单酶水解

根据大豆分离蛋白酶解工艺的特性，经过筛选，得到几种比较理想的工具酶：碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶，固定加酶量5 000U/g SPI条件下，通过单因素及正交试验进行条件优化，得出这3种单酶的最适水解条件，结果见表2。

表23 种蛋白酶的最佳水解条件Table 2 The optimum hydrolysis conditions of three kinds of protease

2.2 复合酶水解

将碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶进行复配。以3种酶的比例、pH值、温度、酶解时间为试验因素，每个因素选取3个水平，以酶解收率为考察指标，采用L9（34）正交设计进行试验，确定复合酶水解大豆分离蛋白的最佳酶解工艺条件组合，结果与分析见表3，方差分析见表4。

表3 大豆分离蛋白酶解条件优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment for soy protein isolate hydrolysis condition optimization

表4 正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment results

由表3、表4可知，加酶比例是影响大豆分离蛋白酶解收率的最主要因素，其次是酶解时间、温度，pH极差最小。综合分析可知，最佳组合为A2B2C2D3，即加酶比1∶2∶3，pH值为8.5，温度50℃，酶解时间4.5h。在此优化酶解条件下，进行验证试验，复合酶得出酶解收率为86.76%。

2.3 单酶水解与三酶复配水解效果对比

在其他酶解条件相同（固液比1∶25，加酶量5000U/gSPI，酶解时间4.5h）的条件下，在3种单酶及复合酶的最佳酶解条件下，单酶水解与复合酶水解的酶解收率与苦味值结果见表5。

表5 单酶与复合酶水解效果对比Table 5 Comparison of the hydrolysis effect of single enzyme and compound enzyme

由表5可知，对比单酶与复合酶的水解效果，复合酶解收率仅略低于碱性蛋白酶，高于中性蛋白酶及胰蛋白酶，复合酶酶解的苦味值明显低于单酶酶解。对比单酶与复合酶酶解的酶解收率及苦味值两方面因素，复合酶更适合用于制备高收率、低苦味的大豆低聚肽。

3 结论

复合酶解大豆分离蛋白的最佳酶解条件为加酶比（碱性蛋白酶/中性蛋白酶/胰蛋白酶）1∶2∶3，pH值8.5，温度50℃，酶解时间4.5h，在此最佳条件下，酶解收率为86.76%。通过酸溶蛋白含量的测定方法测得水解液中小分子大豆蛋白含量为98.04%。大豆肽的功能特性和营养特性主要由肽体现，游离氨基酸并不是所需要的功能性成分，所以，要保证生产高纯度的大豆低聚肽，必须控制游离氨基酸含量，游离氨基酸含量为4.55%。通过计算，得到大豆低聚肽含量为93.49%。人类摄食的蛋白质主要在胃及肠道中水解成肽，以肽的形式消化吸收[14]，二肽和三肽的吸收速度比相同组成的氨基酸更快[15]。所以大豆低聚肽更易被肠道消化吸收，能较快的为人体提供能量。复合酶解同单酶酶解效果相比，在保证适宜酶解收率的条件下，又能大大降低酶解液的苦味值。考虑酶解收率及苦味值方面因素，复合酶解比较适合用于制备高收率、低苦味值的大豆低聚肽。

[1]邵伟，熊泽，何晓文.发酵大豆多肽及其功能研究[J].中国酿造，2005，24（6）：23-25.

[2]姜曼，宋俊梅.大豆肽研究概况[J].中国酿造，2009，28（3）：8-11.

[3]黄俪虹.大豆多肽的生理功能及应用（一）[J].食品科技，1999（3）：50-51.

[4]李荣和，姜浩奎.大豆深加工技术[M].北京：中国轻工业出版社，2012.

[5]周立亘，陈新锋，王君虹，等.大豆多肽复合酶解工艺条件研究[J].食品科技，2005（7）：22-25.

[6]富校轶，陈武，许慧，等.大豆功能肽的研究进展[J].大豆科技，2008（6）：31-33.

[7]荣建华，李小定，谢笔钧，等.大豆肽体外抗氧化效果的研究[J].食品科学，2002，23（11）：118-120.

[8]邹远东.超越氨基酸直指现代病[J].当代经济，2002（2）：26-28.

[9]卫琳，宋俊梅，黄永锋.大豆肽的功能性质及提取方法的发展现状[J].中国酿造，2008，27（12）：8-9.

[10]秦思思，宋俊梅，刘天蒙.发酵豆粕制备大豆肽饮料发酵条件的研究[J].中国酿造，2001，20（8）：129-132.

[11]王玲琴，王志耕，方玉明，等.双酶法制备大豆降胆固醇活性肽的研究[J].大豆科学，2010，29（1）：109-112.

[12]吴建中，赵谋明，宁正祥.双酶法生产杜苦味大豆多肽研究[J].食品工业科技，2003，24（4）：24-27.

[13]管风波，宋俊梅.液体发酵豆粕制备大豆肽的研究进展[J].中国酿造，2008，27（12）：24-26.

[14]刘传富，董海洲，刘晓婷.大豆多肽及其在食品工业中的应用[J].粮食与油脂，2002（10）：31-32.

[15]李绩.大豆多肽的功能特性和应用[J].山东食品发酵，2003（3）：42-44.

Preparation of soy oligopeptides with high yield and low bitterness

GU Yu1,LIU Yan2,TU Yu1,LU Mingchun1*
(1.College of Food Science,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China; 2.Jiangsu Sanyi Scientific Research Centre,Pizhou 221300,China)

Taking soybean protein isolate residue as raw material,the optimal hydrolysis process was studied with the enzymatic hydrolysis yield as index.On the basis of single enzyme hydrolysis,compound enzyme of alkaline protease,neutral protease and trypsin were used to conduct orthogonal experiment.The optimum hydrolysis condition of compound enzyme were determined by the orthogonal experiment as follows:alkaline protease, neutral protease and trypsin ratio 1∶2∶3,temperature 50℃,time 4.5 h.Under the optimized condition,the enzymatic hydrolysis yield was 86.76%,soy oligopeptides content was 93.49%,and the bitterness value was significantly lower than single enzyme hydrolysis product.

soybean oligopeptides;enzyme hydrolysis yield;bitterness value

TS201.2

A

0254-5071（2014）04-0087-03

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.021

2014-02-28

辽宁省教育厅创新团队项目（2008T009）

谷宇（1990-），女，硕士研究生，研究方向为食品资源开发与利用。*

芦明春（1956-），男，教授，本科，研究方向为农产品加工。