葡聚糖酶产生菌的诱变选育

郭成栓

（广东食品药品职业学院生物技术学院，广东广州510520）

葡聚糖酶产生菌的诱变选育

郭成栓

（广东食品药品职业学院生物技术学院，广东广州510520）

利用紫外线诱变育种方法分离对前期分离到一株葡聚糖酶野生菌株P5进行诱变。通过平板初筛、摇瓶复筛，从诱变菌株中筛选出一株高产菌株，其发酵酶活力可以达到5.85U/mL；在此基础上，对诱变菌株的发酵产酶工艺进行了初步的优化，其最适碳源为淀粉，最适氮源为花生饼粉，正交试验结果表明，淀粉含量为5%、花生饼粉含量为4%、NaH2PO4含量为0.2%时，该菌株的产酶量最高，酶活力达到21.23U/mL。

枯草芽孢杆菌；葡聚糖酶；酶活力；诱变；突变株

狭义的葡聚糖酶特指内切β-1,3-1,4-葡聚糖酶，是一种重要的工业用酶，在生产生活中广泛应用于酿造、饲料、食品、纺织等诸多行业[1-6]。β-1,3-1,4-葡聚糖酶的主要来源为微生物[7-12]，包括细菌、真菌、放线菌等，其中芽孢杆菌是产生葡聚糖酶的一种主要菌种，在生产生活中具有较大的研究价值。

葡聚糖酶的酶活性低是影响生产应用的一大瓶颈，因此往往要对野生菌株进行选育。近来，虽然基因工程等育种方法在微生物育种工作中发挥着越来越大的作用[13-14]，但是，传统的诱变育种在大多数工业微生物育种中仍占有重要的地位[15-16]。从自然界筛选β-1,3-1,4葡聚糖酶高产菌株，对其进行诱变育种并从中筛选产酶活力高的突变株仍是对其进行应用研究的常用方法和途径。

微生物的代谢过程受到培养基及培养条件的影响，要利用微生物发酵生产该酶，优化其发酵产酶的工艺条件，对于其生产应用也非常关键，国内外[8，10，12]也开展了相关的研究工作。因此本研究以前期筛选获得的具有较高葡聚糖酶活力的枯草芽孢杆菌P5为试验菌株，对其进行紫外线诱变育种，通过诱变筛选，以获得葡聚糖酶产量提高的正向突变株，在此基础上初步研究该突变菌株的产酶条件，以为葡聚糖酶的生产及应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株

枯草芽孢杆菌P5：前期分离得到[17]。

1.1.2 培养基

种子培养基：0.5%牛肉膏、1%蛋白胨、0.5%酵母膏，pH=7.0，121℃灭菌20min。

发酵培养基：0.5%葡聚糖、0.5%牛肉膏、1%蛋白胨、0.5%酵母膏，pH=7.0，121℃灭菌20min。

筛选培养基：0.5%葡聚糖、1%蛋白胨、0.5%酵母膏、0.004mg/mL刚果红、2%琼脂，pH=7.0，121℃灭菌20min。

1.1.3 试剂

10mg/mL的葡萄糖溶液：称取无水葡萄糖1.0g定容至100mL。

0.05 mol/L柠檬酸缓冲液，pH=4.8缓冲溶液的配制[1]。

1.0 %的葡聚糖底物：称取β-葡聚糖1.000 0g溶于100mL 0.05mol/L的酸性缓冲液中，磁力搅拌至完全溶解（室温条件下3h以上）。标记为1.0%β-葡聚糖酸性溶液，同时标记pH=4.80、4℃保存。

DNS试剂：10g 3,5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS），置于600mL水中，逐渐加入20g NaOH，在50℃水浴中搅拌溶解，再依次加入200g酒石酸钾钠，5g苯酚和5g无水亚硫酸钠，待全部溶解后，冷却至室温，用水定容至1 000mL。贮存于棕色瓶中暗处放置7d后使用。

1.2 仪器与设备

QYC200全温度恒温培养摇床：上海福玛实验设备有限公司；UV-2012 PC型紫外可见分光光度计：上海达平仪器有限公司；SW-CJ型净化工作台：苏州净化设备公司；eppendof 5810高速冷冻离心机：艾本德中国有限公司；DHP-9052恒温培养箱：上海一恒科学仪器有限公司；LDZX-40BI型立式自动电热压力蒸汽灭菌器：上海中安医疗器械厂；YXK.SJ41.280A高压灭菌锅：上海申安医疗器械厂。

1.3 方法

1.3.1 紫外诱变方法

菌悬液的制备：用无菌生理盐水洗下营养琼脂培养基上枯草芽孢杆菌，振荡使菌体分散均匀，经血球计数板计数后，调整菌体数量约为106个/mL，备用。

紫外诱变处理：将菌悬液用无菌生理盐水稀释至106个/mL，移至无菌平皿中，置于磁力搅拌器上，在15W紫外灯下距离30cm处进行诱变处理。将未经诱变处理及诱变处理后的菌悬液各取0.1mL分别涂布于初筛培养基上，37℃暗室培养2d，计算致死率，以致死率70%～90%为最佳诱变时间。

1.3.2 筛选方法

平板初筛：待初筛培养基上长出菌落后，挑选菌落水解圈直径和菌落直径比值（HC值）相对较大的菌落转接到斜面培养基上，以待进一步复筛。

摇瓶复筛：将平板初筛获得的菌株接种至液体产酶培养基中，37℃、200r/min振荡培养2d，测定发酵液的酶活力。

1.3.3 发酵工艺的初步优化

碳源对产酶的影响：以1%（w/v）蛋白胨分作为氮源，碳源分别采用1%（w/v）的葡聚糖、乳糖、葡萄糖、蔗糖和可溶性淀粉作为碳源，考察不同碳源对葡聚糖酶活力的影响。

氮源对产酶的影响：以1%（w/v）的可溶性淀粉作碳源，分别采用1%（w/v）的酵母粉、蛋白胨、大豆饼粉、花生饼粉、硫酸铵作为氮源，考察不同氮源对葡聚糖酶活力的影响。

无机盐对产酶的影响：在只含碳源、氮源的培养基中，分别添加0.1%（w/v）的CaCl2、MgSO4、NH4Cl、NaH2PO4、KH2PO4、ZnSO4，考察不同无机盐对葡聚糖酶活力的影响。

碳源及氮源正交试验优化：以淀粉、花生饼粉、NaH2PO4作为3因素，采用3水平正交试验：淀粉（3.0%、4.0%、5.0%）、大豆饼粉（3.0%、4.0%、5.0%），NaH2PO4（0.1%、0.2%、0.3%）培养基装量为50mL，自然pH值，接种量体积分数为5%，37℃、200r/min发酵48h，测定酶活力。

1.3.4 葡聚糖酶酶活力测定[17]和定义

酶活定义：在试验条件下，每分钟分解β-葡聚糖产生相当于1μmol还原糖（以葡萄糖计）所需的酶蛋白的量定义为1个酶活单位（U/mL）。

2 结果与分析

2.1 紫外线诱变时间的选择

将出发菌株分别置于紫外灯下照射30s、60s、90s、120s、150s、180s、210s、240s，然后将诱变菌株及出发菌株稀释到合适的浓度，涂布于葡聚糖筛选平板上，分别计数出发菌株及诱变菌株的菌落数，计算不同照射时间的致死率结果见图1。由图1可知，紫外线照射180s时，菌株的致死率达到80%，所以选择180s作为出发菌株的诱变时间。

图1 出发菌株的紫外诱变曲线Fig.1 UV mutation curve of original strain

2.2 葡聚糖酶高产菌株的初步筛选

表1 初筛出发菌株与突变菌株的比较Table 1 Comparison of preliminary screening original strain and mutant strain

将紫外线诱变后的枯草芽孢杆菌涂布在葡聚糖平板上面，37℃暗室培养2d，测量葡聚糖平板上菌落水解圈直径以及菌落直径，挑选菌落水解圈直径与菌落直径比值（HC值）较大的单菌落，葡聚糖平板上面挑选出5株比值较大的菌落（见表1）。从表1可以看出，从突变株Tb3的HC值最大，是出发菌株的1.62倍，初步判断具有较高的产酶能力，这也说明，从紫外线诱变的突变株中筛选出了少数发生了正向突变的突变株，至于在液体培养基中他们发酵产酶的能力如何，还有待进一步摇瓶复筛进行验证，所以将筛选出的5株HC值较大的菌落接种到斜面上保存，以供进一步进行摇瓶复筛。

2.3 葡聚糖酶高产菌株的复筛

将初筛得到的5株水解圈直径/菌落直径比值较大的菌株接种到摇瓶中，置于摇床上37℃振荡培养2d，发酵液离心，取上清液，测定酶活力，结果见表2。由表2可知，在初筛出来的5株突变株中，Tb3菌株的葡聚糖酶活力最高，达到5.28U/mL，其他几株突变株的酶活力大于初始菌株，这说明初筛得到的几株HC比值较大的菌株在液体培养基中也具有较高的产酶能力，与初筛结果基本吻合。在该试验中对于出发菌株只是使用了一种诱变剂进行了一轮诱变，初始菌株的产酶能力得到了一定程度的提高，但是提高的幅度有限，所以在后续研究中，可以采用复合诱变剂进行多轮诱变，该菌株产酶的能力会得到进一步提高[18-19]。

表2 复筛出发菌株与突变菌株葡聚糖酶活力的比较Table 2 Glucanase activity comparison of secondary screening strain and mutant strain

2.4 碳源对产酶的影响

碳源对产酶的影响试验结果如图2所示。由图2可知，碳源中，葡聚糖诱导产酶的活性最高，其次是可溶性淀粉，两者差别不大，考虑到工业生产成本，碳源采用可溶性淀粉，因为其原料广泛，成本低廉。当碳源采用1%的可溶性淀粉时，酶活力可以达到7.52U/mL。

图2 碳源对产酶的影响Fig.2 Effect of carbon source on glucanase production

2.5 氮源对产酶的影响

氮源对产酶的影响试验结果如图3所示。由图3可知，氮源中，花生饼粉的产酶效果最好，其次为大豆饼粉、蛋白胨，而无机氮源硫酸铵则产酶量比较低。花生饼粉作为榨油的副产品，来源广，价格低廉，当氮源采用1%的花生饼粉时，酶活力可以达到10.28U/mL，这对其进行工业化生产是非常有利的。

图3 氮源对产酶的影响Fig.3 Effect of nitrogen source on glucanase production

2.6 无机盐对产酶的影响

无机盐一方面是微生物生长所必需的营养物质，同时又可以起到调控渗透压的的作用，对微生物的生命活动及酶活性的调控具有重要的作用。从图4可以看出，培养基中添加的各种无机盐对酶活力的影响，其中添加NaH2PO4后，葡聚糖酶活力最高，达到12.50U/mL。这可能是因为NaH2PO4中的磷可能是葡聚糖合成过程中所需酶或辅酶的组成元素，因此对葡聚糖酶的合成具有重要的影响，同时NaH2PO4中的钠离子可能对葡聚糖酶的生产也具有一定的促进作用。

图4 无机盐对产酶的影响Fig.4 Effect of different inorganic salts on production of glucanase

2.7 培养基优化正交试验

在单因素试验中，筛选出了最优碳源、氮源及无机盐，所以分别以最优碳源（淀粉）、氮源（花生饼粉）、无机盐（NaH2PO4）作为影响因素，进一步探讨各因素不同水平对枯草芽孢杆菌产葡聚糖酶的影响，进行正交试验，试验结果见表3。

由表3可知，从R值大小可以看出，葡聚糖酶产酶量影响因素大小为可溶性淀粉>花生饼粉>NaH2PO4，可溶性淀粉对葡聚糖酶生产的影响最大，在3因素中极差最明显。从K值大小可以得到发酵最适水平组合为A3B2C2，即可溶性淀粉5.0%、花生饼粉4.0%及NaH2PO40.2%，但是这一方案未包含在正交试验方案中，因此将试验菌株接种在该组合培养基中进行酶活力验证试验，酶活力测定结果表明该培养基条件发酵产酶的活力可以达到21.23U/mL。

表3 培养基配方优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment for mediumformula optimization

在该项研究中对发酵产酶进行了一个初步的优化，只是对发酵产酶的单一碳源及氮源进行了优化，实际上，在发酵过程中，不同的碳氮源之间有时具有互补效应，因此采用复合碳氮源有时反而会提高产酶的能力[20]，所以后续研究中，可以进一步对该菌株发酵产酶的复合碳源及氮源进行优化，同时进行更多因素更多水平的优化，从而得到更优的培养基配方，进而提高该菌株发酵产酶的能力，为利用该菌株发酵进行酶的生产及应用奠定坚实基础。

3 结论

3.1 利用紫外线诱变育种方法，对从土壤中筛选出的一株葡聚糖酶高产菌株进行了诱变育种，利用葡聚糖平板初筛，从突变菌株中筛选出了5株HC值较大的菌株，然后将5株突变菌株接入摇瓶进行复筛，结果从5株突变菌株中筛选出一株葡聚糖酶高产菌株Tb3，其摇瓶发酵酶活力达到5.28U/mL，其他4株突变株的酶活力也得到了一定程度的提高。

3.2 对枯草芽孢杆菌菌株Tb3液体发酵条件产酶的条件进行了初步的研究，初步研究结果表明，该菌株液体发酵产酶的最适碳源为可溶性淀粉，最适氮源为花生饼粉。在此基础上对最适碳源、最适氮源以及无机盐进行了3因素3水平的正交试验，结果表明，可溶性淀粉对葡聚糖酶生产的影响最大。当最适碳源可溶性淀粉含量为5.0%，最适氮源花生饼粉含量为4.0%，无机盐NaH2PO4含量为0.2%时，其发酵酶活力最高，达到21.23U/mL。

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Mutation breeding of high glucanase producing strain

GUO Chengshuan
（College of Biotechnology,Guangdong Food and Drug Vocational Institute,Guangzhou 510520,China）

UV mutation breeding method was used to mutate a glucanase-producing wild strain P5 isolated in earlier stage.A high glucanase-producing strain was screened by plate screening and shaking flask culture with glucanase activity of 5.85 U/ml.Furthermore,the fermentation medium of mutant strain was optimized,and the optimum carbon source and nitrogen source was starch and peanut meal,respectively.The optimum medium formula was determined as follows:soluble starch 5%,peanut meal 4%,NaH2PO40.2%.Under these conditions,the fermentation glucanase activity reached up to 21.23 U/ml.

Bacillus subtilis;glucanase;enzyme activity;mutation;mutant strain

TS201.3

A

0254-5071（2014）04-0090-04

10.3969/j.issn.0254-5071.2014.04.022

2014-02-28

2013年建设中医药强省科研项目（20131277）；广东食品药品职业学院自然科学青年基金项目（2009YZ005）

郭成栓（1977-），男，讲师，博士，主要从事发酵工程、酶工程的研究工作。