光照对酱油发酵影响初步研究

时间：2024-07-28

李学伟，朱新贵*，王婷婷，曾小波

（李锦记（新会）食品有限公司，广东新会 529156）

酱油酿造的历史中，我国传统酱油都需要经过“日晒夜露”。有研究认为，酱油天然晒露过程中，太阳光为酱油所吸收，除了光能转化为热能外，还可能产生光化反应[1]。理论上，酱油的酱醪中存在许多不饱和键，有些能够吸收相应波长的光，从而引起各种物理变化或者化合物分子键的伸缩卷曲、碰撞等化学变化，从而有可能影响酱油的色泽及其他理化性质[2]。目前，国内许多知名酱油仍采用天然晒露工艺酿制[3]，相比较，日式酱油并没有采用中式酱油的“日晒夜露”工艺，特别是缺乏光照的因素，但其利用“春曲、夏酱、秋油”自然气温变化发酵的规律，采用控温控氧发酵的方法，酿造出来的酱油却一直以滋味鲜美，酱香、醇香、酯香浓郁占据国际酱油消费的高端市场[4-8]。

我国传统酱油“日晒夜露”酿造方法，讲究的是温度、光、空气和自然微生物。这种传统的工艺，除了已知温度、空气和微生物在酿造中所起的作用外，对光照所产生的作用缺乏深入研究。光照作为重要的环境因子之一，具有热效应和光化学作用，能够产生光热效应或光化学作用的往往是特定波长的光和特定的底物[9-15]。目前已有研究表明，光照能够调节多种微生物的生长发育、代谢、向光性和生理节律变化等生命活动[16-19]。

本研究通过不同光质对酱油品质的影响以及比较无光控温发酵酱油与传统晒露发酵酱油的差异，初步探究光照在酱油酿造中对其品质的影响，以期从不同角度对酱油风味的产生机理进行研究，也为工艺设计和改进提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

黄豆成曲和盐（李锦记（新会）食品有限公司提供）。

1.2 主要试剂

氢氧化钠、甲醛、盐酸、葡萄糖、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、乳酸钠、乳酸（分析纯）：中国医药（集团）上海化学试剂公司；干酪素（分析纯）：杭州微生物试剂厂；氨基酸（17种）（色谱纯）：美国Sigma公司。

1.3 仪器与设备

紫外可见分光光度计：北京莱伯泰科仪器有限公司；Brix计：日本ATAGO公司；电热恒温水浴锅：北京精科华瑞仪器有限公司；全自动滴定仪：瑞士万通（中国）有限公司；气相色谱-质谱联用仪：美国Finnigan公司；HP-INNOWAX毛细管柱：上海笛柏实验设备有限公司；全自动氨基酸分析仪：德国Sykam公司。

1.4 试验方法

1.4.1 构建不同光质发酵罐

红光、绿光和蓝光为三原色光，其他色光均由三原色光构成。因此，选取三原色光作为构建不同光质发酵罐的基础条件。分别将三原色膜进行透射光光谱扫描，结果见图1。

图1 单色膜透射光谱图Fig.1 Spectra of monochrome film transmittance

由图1可见，红膜对620nm～760nm波长范围内的红光透光性在85%以上；绿膜对537nm～510nm波长范围内的绿光透光性达99%以上；蓝膜对463nm～476nm波长范围内的蓝光透光性达95%以上。因此，选用红膜、绿膜、蓝膜3种单色膜包裹发酵罐得到不同光质的发酵罐，用报纸和黑色塑料袋包裹发酵罐得到无光发酵罐，透明玻璃罐为白光发酵罐。

1.4.2 不同光质对发酵酱油品质的影响

在不同光质的发酵罐中，按1∶2的比例加入成曲和20%（w/w）浓度的盐水，在室外非阳光直射条件下发酵3个月，以无光条件下的发酵为对照。加入盐水1d后测定各指标为初始值，后期定期循环，取样测定发酵液的色泽A530、固形物含量、氨氮含量、总酸含量、红指、黄指、还原糖含量等指标。

1.4.3 无光控温发酵酱油与传统晒露发酵酱油的比较

在无光发酵罐和光照发酵罐中，按1∶2的比例加入成曲和20%（w/w）浓度的盐水，按高盐稀态发酵工艺进行定期循环浇淋。无光发酵罐进行无光控温发酵，0～30d温度控制在33℃～35℃，30d～60d温度控制在31℃～33℃，60d～90d自然温度；光照发酵罐进行日晒夜露自然发酵。从第4d开始，定期取样测定酱油的酸性和中性蛋白酶活力。发酵结束后，进行氨基酸成分和挥发性成分分析。

1.4.4 常规指标测定

总氮、氨氮、总酸、色泽A530（稀释10倍）、感官评定（每项最高分为10分）均按GB 18186-2000规定测定；还原糖按GB/T 5009.7-2008规定测定；固形物采用Brix计测定；蛋白酶活力按SB/T 10317-1999规定测定。

酱油红色指数和黄色指数的测定：将酱油样品准确稀释10倍，分别在波长460nm、510nm和610nm下测得吸光度值A1、A2和A3，红色指数由10×lg（A2/A3）表示，黄色指数由10×lg（A1/A3）表示[20-21]。

1.4.5 氨基酸的测定—柱前衍生法

参考《实用食物营养成分分析手册》中柱前衍生法测定酱油里的氨基酸[22]。

1.4.6 酱油挥发性成分测定

固相微萃取：取样品30mL于100mL顶空样品瓶，密封后，置于40℃水浴锅中电解搅拌，固相微萃取纤维顶空萃取30min，250℃解吸3min后进样。

气相色谱分析条件：HP-INNOWAX毛细管柱（30mm×0.25mm）；载气He，流速1.0mL/min；程序升温，起始温度45℃保持5min，升温速率5℃/min，温度至200℃，保持15min，升温速度10℃/min，最终温度220℃，保持5min；汽化室温度220℃，进样量0.8μL。

质谱分析条件：EI离子源，电子能量70eV，发射电流200μA，电子倍增器电压350V，离子源温度200℃，质量扫描范围35amu～335amu。

数据处理：实验数据处理由Xcalibur软件完成，在NIST谱库（107000个化合物的数据）和Wiley谱库（320000个化合物的数据，Version6.0）对未知化合物进行检索并计算匹配度，只有当正反匹配度均大于800（最大值为1000）时才能确证该物质。

2 结果与分析

2.1 不同光质对发酵酱油品质的影响

2.1.1 酱油发酵过程中各理化指标的差异分析

酱油在不同光质下发酵3个月，测定酱油发酵过程中的色泽A530、固形物含量、氨氮含量、总酸含量、红指、黄指、还原糖含量等指标，结果见图2～图5。

由图2～图5可知，不同光质发酵酱油在其色泽A530、氨氮含量、固形物含量、还原糖含量、总酸含量、红指、黄指等指标之间的变化率没有明显差异（p>0.05）。酱油整个发酵过程非常复杂，存在淀粉的糖化、糖分的降解、酒精发酵、蛋白质水解、香气的形成、生酸反应和美拉德褐变等生化反应，这些反应影响酱油的理化指标。但是，这些反应的进行主要受到发酵的微生物、温度、pH值、氧气等因素影响[23]。光的作用主要表现为使酱醪温度增加，而光的光化作用可能促进上述反应的进行或影响微生物繁殖代谢，但实验结果表明在酱油复杂的发酵体系中，光的光化作用对酱油的理化指标影响很小。

2.1.2 不同光质发酵酱油的感官评定

由表1可知，不同光质发酵的酱油在色泽、香气、滋味方面均没有显著差异（p>0.05），表明不同光质对发酵酱油的感官品质也没有显著影响。

图2 不同光质发酵酱油的色泽A530（a）和固形物含量（b）的变化率Fig.2 Change rate of color index A530(a) and solid content in different kinds of soy sauce treated by different light qualities

图3 不同光质发酵酱油的氨氮含量（a）和总酸含量（b）的变化率Fig.3 Change rate of color index A530(a) and solid content (b) in different kinds of soy sauce treated by different light qualities

由此可见，不同光质对发酵酱油的色泽A530、固形物含量、氨基含量、总酸含量、红指、黄指和还原糖含量等指标，以及感官品质没有显著影响。

2.2 无光控温发酵酱油与传统晒露发酵酱油的比较

图4 不同光质发酵酱油的红指（a）和黄指（b）的变化率Fig.4 Change rate of red index (a) and yellow index (b) in different kinds of soy sauce treated by different light qualities

图5 不同光质发酵酱油的还原糖含量变化率Fig.5 Change rate of reducing sugar content in different kinds of soy sauce treated by different light qualities

表1 不同光质发酵酱油的感官评定Table 1 Sensory evaluation of different kinds of soy sauce treated by different light qualities

2.2.1 无光控温与传统晒露发酵酱醪中的蛋白酶活力以及氨基酸态氮含量比较

在发酵过程中，跟踪无光控温发酵酱油和传统晒露发酵酱油的中性蛋白酶（NP）和酸性蛋白酶（AP）活力，以及氨氮含量的变化，结果见图6和图7。

图6 无光控温与晒露发酵液NP（a）和AP（b）活力的变化曲线Fig.6 Change rate of NP (a) and AP (b) of temperature-controlled and the traditional Chinese-type soy sauce

图7 无光控温与晒露发酵酱油氨氮含量的变化曲线Fig.7 Change rate of ammonia nitrogen content of temperaturecontrolled and the traditional Chinese-type soy sauce

由图6和图7可见，无光控温发酵酱油中的中性和酸性蛋白酶活力下降得较快，但氨氮含量却增加得较快。

NP的酶活力在第4d～25d发酵期间出现快速下降，无光控温发酵酱油的NP酶活力由610.16U/mL下降为87.84U/mL，而传统晒露发酵酱油里的NP酶活力由721.36U/mL下降为309.92U/mL；发酵至50d左右，无光控温发酵酱油的NP酶活力几乎为零，而传统晒露发酵酱油的NP酶活力在后期发酵中下降非常缓慢。

AP的酶活力在第4d～16d发酵期间也快速下降，无光控温发酵酱油的AP酶活力由203.2U/mL下降为87.76U/mL，而传统晒露发酵酱油里的AP酶活力由266.4U/mL下降为118.32U/mL；发酵60d后，无光控温发酵酱油的AP酶活力继续快速降低，最后降为21.77U/mL，而传统晒露发酵酱油的AP酶活力则下降非常缓慢，最后仍保持106.31U/mL。

酶受温度的影响有两方面，一般规律是温度每上升10℃反应速度增加2倍，但高温会使酶蛋白变性和内部疏水基团暴露，最后失去催化能力。米曲霉蛋白酶的最适温度为40℃～45℃[8]。结合图9进行分析，无光控温发酵酱油的平均发酵温度在33℃左右，虽然能促进酶的水解速率，但会缩短酶的存活时间；而传统晒露发酵酱油的平均发酵温度在27℃左右，虽然蛋白酶的水解速率会降低，但酶的存活时间得到延长。另外，在发酵后期，无光控温发酵酱油的氨氮含量有所降低，可能部分氨基酸参与了美拉德反应以及被酵母繁殖所利用。

2.2.2 无光控温发酵酱油与传统晒露发酵酱油氨基酸成分比较分析

在酱油酿造过程中，蛋白质原料在蛋白酶的作用下，降解成胨、多肽、氨基酸。国标中通常以氨基酸态氮的含量作为衡量成品酱油等级的标准。有些氨基酸是呈味的，如谷氨酸和天冬氨酸具有鲜味，甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸等具有甜味，酪氨酸、组氨酸等具有苦味[23-24]。由此可见，游离氨基酸的种类和含量是影响酱油风味的重要因素。因此，比较游离氨基酸的组成，能更好分析无光控温发酵酱油与传统晒露发酵酱油的品质差异。

表2 无光控温发酵酱油与传统晒露发酵酱油的游离氨基酸组成Table 2 Free amino acid composition in temperature-controlled and the traditional Chinese-type soy sauce

由表2可知，无光控温发酵酱油和传统晒露发酵酱油的总游离氨基酸含量分别为5.246g/100mL和4.480g/100mL。前者是后者的1.17倍，其中鲜味、甜味和苦味氨基酸分别为0.958g/100mL和0.744g/100mL、1.909g/100mL和1.667g/100mL、2.366g/100mL和2.042g/100mL。氨基酸主要由蛋白酶水解蛋白质产生，而温度能促进该反应进行。试验过程中，无光控温发酵酱油和传统晒露发酵酱油的平均发酵温度分别为33℃和27℃左右，因此，前者的发酵温度更有利于氨基酸的产生。

2.2.3 无光控温发酵酱油与传统晒露发酵酱油挥发性成分比较分析

无光控温发酵酱油与传统晒露发酵酱油主要挥发性物质的定性，以及含量差异（峰面积归一法）见表3。

由表3可以看出，通过质谱定性后，共筛选出35种特征挥发性风味组分进行比较分析，主要有醇类、酸类、醛类、酯类、酚类和其他等6大类。

酱油中的醇类物质主要以低级醇乙醇为主，此外还有异戊醇、2，3-丁二醇、1-辛烯-3-醇、3-甲硫基丙醇和苯乙醇等高级醇，都是酱油独特的挥发性成分。检测到的10种醇类物质中，有6种在无光控温发酵酱油中的含量均比传统晒露发酵酱油高，但是无光控温发酵酱油的乙醇含量相对较低，可能原因是乙醇与有机酸进行后续的酯香反应。总的来说，无光控温发酵的醇类化合物的含量比晒露发酵高。醇类化合物的产生与酵母的繁殖代谢有关，但酵母的生长繁殖在紫外线辐射下会受到一定程度的抑制[25-26]，这可能是导致无光控温发酵酱油某些醇类物质含量较高的原因。

无光控温发酵酱油明显检测到乙酸和乳酸，而传统晒露发酵酱油只检测到乙酸，而且其含量较高。乙酸和乳酸是酱油酸类物质的主要的成分，除了作为风味物质外，还起到缓解咸味和柔和各种香味，使后味延长。酸类物质主要来源酵母的三羧酸循环和乳酸菌等[23]。

除了α-亚乙基-苯乙醛外，无光控温发酵酱油的醛类物质含量均比传统晒露发酵酱油高。一般的醛类物质本身不是风味成分，但其能与醇类物质反应或缩合而形成香气物质。

无光控温发酵酱油中的琥珀酸二乙酯、苯乙酸乙酯、醋酸苯乙酯和邻苯二甲酸二异丁酯的含量均比传统晒露发酵酱油高，而且，这几个酯类物质都具有明显的花香和果香气味。但乳酸乙酯在无光控温酱油里却检测不到。高级脂肪酸乙酯在无光控温发酵酱油中的含量比传统晒露发酵酱油低。由于无光控温发酵的醇类化合物和有机酸相对丰富，易产生酯化反应。

愈创木酚、4-乙基愈创木酚和4-乙基苯酚均是天然发酵酱油里特有的香气物质，这3种酚类化合物在无光控温酱油里的含量明显比传统晒露酱油高。此外，其他的挥发性物质在无光控温酱油也较丰富。

由此可见，无光控温发酵酱油中的挥发性成分较丰富，而且其大部分醇类、酸类、酯类、醛类、酚类和其他挥发性物质的含量均比传统晒露发酵酱油高。酱油里的风味成分，除了来源原料外，主要与酱油里的微生物代谢、酶促反应和非酶促反应有关，而温度又是促进上述反应的关键因素[23，27]。我国传统酿造酱油在发酵阶段经常暴晒于日光之下，可能主要与太阳光的热能有关。因此，即使在缺乏光照或无光照的条件下，根据微生物的繁殖代谢、酶促和非酶促反应等发酵规律，通过控温酿造，也能获得高品质的酱油。

表3 无光控温酱油与传统晒露酱油中主要挥发性成分比较Table 3 Main volatile components in temperature-controlled and the traditional Chinese-type soy sauce

3 结论

光具有热作用和光化作用，热作用表现为温度的增加，光化作用是指物质在光的照射下发生的化学反应，也称为光化反应[1]。酱油整个发酵过程非常复杂，存在淀粉的糖化、糖分的降解、酒精发酵、蛋白质水解、香气的形成、生酸反应和美拉德褐变等生化反应，这些反应影响酱油的理化指标。而这些反应主要受到发酵微生物、温度、pH值、氧气等因素影响[23]。通过试验，不同光质发酵的酱油在色泽A530、氨氮含量、固形物含量、还原糖含量、总酸含量、红指、黄指等指标之间的变化率没有明显差异（p>0.05）。经感官评价，其色泽、香气、滋味方面也均没有显著差异（p>0.05）。初步研究认为，不同光质对发酵酱油品质没有明显影响。

对无光控温发酵酱油和传统晒露发酵酱油进行比较研究，中性和酸性蛋白酶活力在无光控温发酵酱油中下降得较快，但氨氮含量却有较快的增加。因为在酶适作用温度范围内，较高的温度能促进酶的水解速率，但会缩短酶的存活时间。

无光控温发酵酱油和传统晒露发酵酱油的总游离氨基酸含量分别为5.246g/100mL和4.480g/100mL。前者是后者的1.17倍，其中鲜味、甜味和苦味氨基酸分别为0.958g/100mL和0.744g/100mL、1.909g/100mL和1.667g/100mL、2.366g/100mL和2.042g/100mL。氨基酸主要由蛋白酶水解蛋白质产生，而温度能促进该反应。

对酱油的挥发性成分进行比较分析，无光控温发酵酱油中的挥发性成分较丰富，而且其大部分醇类、酸类、酯类、醛类、酚类和其他挥发性物质的含量均比传统晒露发酵酱油高。这些挥发性物质主要与酱油里的微生物代谢、酶促反应和非酶促反应有关，而温度又是促进上述反应的关键因素。因此，即使在缺乏光照或无光照的条件下，利用自然发酵规律，通过控温发酵，也能获得高品质的酱油。

[1]朱史齐.为发扬我国酱油酿造传统工艺提供资料和看法（下）[J].中国调味品，2007（5）：14-19.

[2]黎景丽.对酱油褐变和二次沉淀的研究[J].中国调味品，1985（2）：3-7.

[3]李金红.改进酱油酿造工艺提高风味[J].酿造与检测，2006（3）：22-24.

[4]王洪升，王素珍，马净丽.耐盐乳酸菌在高盐稀态酱油中的应用[J].中国酿造，2004（10）：30-37.

[5]何胜华，马莺，李海梅.韩国高盐稀态发酵酱油速酿工艺的探讨[J].中国酿造，2005（9）：46-47.

[6]鲁肇元，魏克强.酿造酱油高盐稀态发酵工艺综述[J].中国调味品，2006（1）：29-31.

[7]黄持都，鲁绊，记凤娣，等.酱油研究进展[J].中国酿造，2009（10）：7-9.

[8]魏鹏飞.酱油发酵关键工艺优化及其对酱油品质的影响[D].无锡：江南大学，2011.

[9]YANGW T，MIND B.Chemistry of singleoxygen oxidation of foods[J].Am Chem Soc,1994(2)：15-29.

[10]JENSK S，JENSS，METTEB，et al.Effect of residual oxygen on color stability during chill storage of sliced,pasteurized ham packaged in modified atmosphere[J].Meat Sci，2000(54)：399-405.

[11]彭姣凤，张磊.光氧化的成因及其削减机制[J].生命科学研究，2000，4（2）：83-90.

[12]MARINA J，BERTELSEN G，MORTENSEN G，et al.Light induced color and aroma changes in sliced,modified atmosphere packaged semihard cheeses[J].Int Dairy J，2003，(13)：239-249.

[13]MORTENSEN G，BERTELSEN G，BORGE K，et al.Light induced changes in packaged cheeses[J].Int Dairy J，2004，(14)：85-102.

[14]刘晓庚.光氧化及其对食品安全的影响[J].食品科学，2006，27（11）：579-582.

[15]谭地平，张敬东，郭生练.太阳光对湖泊中有机污染物降解的研究进展[J].环境污染治理技术与设备，2003，4（8）：13-18.

[16]GALLANDP，LEBERTM.Phototropism in phycomyces[J].Photo Sci，2001(1)：621-657.

[17]HE Q，CHENG P，YANG Y，et al.White collar1,a DNA binding transcription factor and a light sensor[J].Science，2002，297(5582)：840-843.

[18]CERDÁ-OLMEDO E,CORROCHANO LM.Genetics ofPhycomycesand its responses to light[J].Compr Ser Photosci，2001，(1)：589-620.

[19]SCHWERDTFEGERC，LINDEN H.Vivid is a flavoproteine and serves as a fungal blue light photo receptor for photo adaptation[J].EMBO J，2003，(22)：46-55.

[20]郑海燕.酱油中红色指数的测定方法[J].中国调味品，1999（1）：27-30.

[21]秦祖赠，陈永梅，粟春富.焦糖色素黄色指数的测定[J].中国调味品，2003（7）：37-39.

[22]杨月欣.实用食物营养成分分析手册[M].北京：中国轻工业出版社，2002.

[23]包启安.酱油科学与酿造技术[M].北京：中国轻工业出版社，2011.

[24]贾爱娟.提高高盐稀态法酿造酱油原料蛋白质利用率及氨基酸出品率的研究[D].陕西：西北农林科技大学，2006.