采用离子交换吸附对蛹虫草中虫草素的提取研究

原晋波，赵 琳，董 超 *，史延茂，崔少飞

（1.河北工业大学 化工学院，天津 300100；2.河北省科学院生物研究所，河北 石家庄 050081）

蛹虫草又名北冬虫夏草、北虫草，是我国名贵中药材之一。虫草素是蛹虫草的主要活性成分，是一种真菌核苷抗生素，具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌、消炎等药理作用[1-5]，由于虫草素可以干扰细胞的DNA和RNA复制，所以在艾滋病治疗方面也有一定的作用[6-7]。

在蛹虫草中虫草素的含量比较低，分子质量小，分离提纯成本高。所以现在还没有虫草素单品作为药物的应用。目前，国内外许多科研工作者对虫草素的分离提纯工艺进行了研究。大多数以索氏提取法、热水浸提法，超声波法以及超临界萃取法等提取虫草素[8-9]，但是从这些方法中得到的虫草素或纯度不高或生产成本高昂。为此，本实验采用离子交换树脂来达到进一步分离纯化虫草素的效果，高效液相色谱法[10-11]测定虫草素含量，最终确定最佳工艺吸附条件。

首先对蛹虫草中的虫草素进行了粗提，然后采用不同的吸附介质对虫草素进行了吸附实验，筛选得到了较好的吸附材料阳离子交换树脂001×16。根据吸附条件采用动力学模型描述了001×16对虫草素的吸附过程，Langmiur等温线和Freundlich 等温线分别被用来描述此吸附系统吸附等温线，其吸附能力和等温线参数被估算，并对两种拟合方式作了比较，为进一步的虫草分离纯化工艺研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蛹虫草：河北省安国市中药材市场；虫草素标准品：上海融禾医药科技发展公司；甲醇（色谱级）：默克化工技术（上海）有限公司；无水乙醇（分析纯）：天津市永大化学试剂开发中心；弱阳离子树脂724、122，强阳离子树脂001×16、001×14，大孔吸附树脂D113、CD180：安徽三星吸附材料有限公司；盐酸（分析纯）：石家庄市试剂厂；氢氧化钠（分析纯）：天津市大陆化学试剂厂。

1.2 仪器与设备

L-2000日立高效液相色谱：天美科技有限公司；FD-27冷冻干燥机：北京德天佑科技发展有限公司；JY92-II超声波破碎机：宁波新芝生物科技股份有限公司；OM-130GB智能鼓风干燥箱：欧迈（上海）科学仪器有限公司；Sartorius PB-10 pH计：浙江象牙县石浦海天电子仪器厂；Sapphire C18色谱柱：美国Sepax technologies公司。

1.3 方法

1.3.1 虫草粗提液制备

市场采购的蛹虫草置于60 ℃烘箱内处理2～3 h，然后粉碎过100目筛，得到均匀的蛹虫草干粉。将水与蛹虫草干粉按照比例20∶1（mL∶g）混合，常温超声2～3次[9]，滤纸过滤，收集滤液，定容，0.22 μm滤膜过滤，HPLC测定虫草素含量。

1.3.2 液相色谱测定方法

L-2000高效液相色谱仪Sapphire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，流速：1.0 mL/min；检测波长：254 nm；进样量：10 μL；柱温：27 ℃；流动相：体积分数为15%的甲醇；洗脱时间：35 min。

1.3.3 吸附介质的预处理

离子交换树脂的预处理：用1 mol/L HCl和NaOH反复浸泡，用1 mol/L NaCl、HCl和NaOH溶液进行转型，再用蒸馏水洗至中性，备用。

大孔吸附树脂的预处理：用1 mol/L HCl和NaOH反复浸泡，用蒸馏水洗涤树脂，再用体积分数为95%的乙醇浸泡树脂6 h，用蒸馏水洗至无醇味，备用。

1.3.4 吸附介质的筛选

将处理好的吸附介质724、122、CD180、D113、001×14.5和001×16沥干，分别称取2 g沥干树脂与10 mL虫草提取液加入三角瓶中，每组三个平行（下同）。测定吸附前后液体中虫草素的含量，选择吸附量最大的吸附介质。

1.3.5 介质吸附虫草素的pH条件

选取介质后，分别调整液体的pH值为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，测定上清液中虫草素含量，得到最佳处理的pH条件。

1.3.6 静态吸附动力学曲线

取1 g处理好的阳离子树脂001×16，加入15 mL虫草素提取液，分别在20 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min、270 min取上清液，测定液体中虫草素含量，绘制动力学曲线。

采用伪一级和伪二级动力学模型对虫草素在001×16树脂上的吸附动力学曲线拟合。

1.3.7 吸附等温线

虫草素粗提液的质量浓度梯度为0.009 84 mg/mL、0.0295 mg/mL、0.049 2 mg/mL、0.070 mg/mL、0.088 9 mg/mL、0.1085mg/mL、0.1283mg/mL、0.1476mg/mL、0.1702mg/mL、0.201 mg/mL、0.254 mg/mL、0.306 mg/mL。

将处理好的沥干树脂0.5 g和不同浓度的虫草素粗提液10 mL，分别在15 ℃、25 ℃、35 ℃静态吸附3 h（根据动力吸附曲线选定），绘制吸附等温线。

分别用Langmiur等温线和Freundlich 等温线[12-13]描述此吸附系统吸附等温线，并估算其吸附能力和等温线参数。

2 结果与分析

2.1 标准曲线回归线性方程的建立

以虫草素质量浓度（x）为横坐标，峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线见图1。虫草素的标准曲线回归方程为y=257 33x－126 736（R2=0.999 7），线性范围是虫草素质量浓度10～320 μg/mL，此范围内线性关系良好，在选定的色谱条件下虫草素出峰时间在17 min左右。检测结果虫草素在蛹虫草中的含量为1 035.7 μg/g，这与凌建亚等[9]的测量结果相似。

图1 虫草素标准曲线Fig.1 Standard curve of cordycepin

2.2 树脂的选择

根据虫草素的结构分析，嘌呤环是强的吸电子基团，氨基上的电子向环内偏移，从而使得氨基带部分正电荷，进行离子交换吸附时优先选择阳离子交换树脂。

计算吸附平衡时吸附量Qe方程式：

式中：Qe为吸附平衡时的吸附量，mg/g；Ce为吸附前虫草素质量浓度，mg/mL；Ci为吸附后虫草素质量浓度，mg/mL；M为吸附剂质量，g；V为虫草素粗提液的体积，mL。

实验也验证阴离子交换树脂对虫草素基本不吸附（数据未给出），在pH值为5，温度为25 ℃，转速180 r/min，虫草素质量质量浓度为0.052 mg/mL条件下，常用的几种阳离子树脂的吸附实验结果见图2。由图2可知，树脂001×16对虫草的吸附量较大，虫草素的离子交换分离纯化中优先考虑树脂的吸附量，这是树脂选择的关键性因素[14-15]，因此选择此树脂做进一步研究。

2.3 pH条件对吸附量的影响

pH能够直接改变吸附剂表面吸附位点和吸附质离子的化学形态，从而影响吸附量。在pH值为5，温度为25 ℃，转速180 r/min，虫草素质量质量浓度为0.052 mg/mL条件下，不同pH对吸附量的影响见图3。由图3可知，当溶液pH＞9时，吸附量急剧下降，是因为碱性增强时虫草素的形态趋于中性分子，失去交换能力，且吸附位点的H+被中和而失去交换位点，最终导致低的吸附量降低；反之当pH值为4～9时，虫草素的阳离子形态得以增多，吸附量增大；但当过酸时，H+浓度增加与虫草素形成竞争吸附关系，吸附量减小。根据实验结果，pH值为4时吸附量最大，因此选择在此条件下研究动力学曲线和吸附等温线。

图2 不同型号树脂的吸附能力Fig.2 Adsorption ability of different resins

图3 不同pH条件下的吸附量Fig.3 Adsorption ability at different pH

2.4 静态吸附动力学曲线

001×16树脂对虫草素的吸附动力学曲线如图4所示。由图4可知，随这时间的延长，001×16树脂对虫草素的吸附量逐渐增加，0～30 min吸附量的增加显著，180 min后随时间的延长，虫草素的吸附量不再增加，这说明001×16树脂对虫草素的吸附达到饱和。

为找到合适的动力学模型描述001×16树脂对虫草素的吸附过程[16]，在pH值为5，温度为25 ℃，转速180 r/min，虫草素质量质量浓度为0.052 mg/mL条件下，树脂001×16吸附虫草素的伪一级和伪二级动力学参数见表1，吸附动力学曲线见图4。分别采用伪一级和伪二级动力学模型对图4吸附动力学曲线进行拟合，结果如图5和表1所示，拟合方程分别为：

式中：Qe为吸附平衡时的吸附量，mg/g；Qt为时间t时的吸附量，mg/g；t为吸附时间，min。

式中：Qt为时间t时的吸附量，mg/g；t为吸附时间，min。

表1 001×16吸附虫草素的伪一级和伪二级动力学参数Table 1 Kinetics fitting parameters of cordycepin adsorption onto 001×16 resin based on pseudo-first-order and pseudosecond-order

注：Qe，exp为实验值；Qe，cal为计算值；Kf为伪一级动力学模型的速率常数；Ks为伪二级动力学模型的速率常数。

由图5可知，t/Qt 对时间t作图得到良好的线性关系，该树脂吸附虫草素的动力学数据与伪二级动力学模型有更好的相关性，且按伪二级动力学方程计算的Qe，cal值于实验值Qe，exp非常接近，说明该树脂吸附虫草素的动力学行为更符合伪二级吸附动力学规律，由于伪二级动力学方程建立于化学反应的机理假设，一定程度上说明化学吸附反应对树脂001×16吸附虫草素的速率起到主要控制作用，其吸附起始的速率常数为h=16.69 μg/（g·min）。

图4 001×16树脂对虫草素的吸附动力学曲线Fig.4 Kinetics plot of cordycepin sorption onto 001×16 resin

图5 伪一级和伪二级动力学方程拟合001×16树脂对虫草素的动力学曲线Fig.5 Kinetics fitting plots of cordycepin sorption onto 0001×16 resin based on pseudo-first-order and pseudo-second-order

2.5 吸附等温线

2.5.1 线性拟合

通过线性拟合和非线性拟合计算得到的等温吸附参数对比见表2，吸附等温线的线性拟合分别见图6（c）及图6（d）。根据拟合相关系数R2，在不同温度条件下Langmuir（L）的R2均高于Freundlich（F）的R2且根据回归平方和（regression square sum，RSS），L模型均低于F模型，说明用L模型描述此吸附等温线更合适。

表2 不同温度下线性拟合和非线性拟合吸附等温线参数比较Table 2 Linear fitting and non-linear fitting adsorption isotherm parameters comparison at different temperature

2.5.2 非线性拟合

吸附等温线的非线性拟合分别见图6（A）及图（B）。对于树脂001×16对虫草素的吸附等温线，非线性拟合与线性拟合的拟合相关系数R2相近，但非线性拟合的RSS要远低于线性拟合的RSS，意味着实验数据被更好的表述，即由非线性拟合计算得到的等温线参数更加准确。

线性拟合不能直接地关联实验原始数据点，计算所得的等温线参数可能存在较大的误差。在非线性拟合中RSS的计算关联每一个原始实验数据，误差分析涉及范围内的所有数据，而由非线性形式转变到线性形式会导致实验误差失真。因此线性拟合和非线性拟合得到的方程对于最大吸附量Qm的预测有大的差异，在实验过程中预测值也会不同。实际中绝大数等温吸附曲线是非线性的，误差分布也会在线性转换中改变，不同的轴向设置也会较大程度的影响R2值，这些最终影响等温线参数的确定；而选用非线性拟合，由如上原因所导致的误差就会避免。这表明获取等温吸附参数，非线性拟合方法更加准确。

根据非线性拟合Langmiur方程，001×16树脂对蛹虫草提取液中虫草素的吸附量在15 ℃、25 ℃、35 ℃时分别是1.296 33 mg/g、1.034 7 mg/g、0.775 56 mg/g，吸附量随温度升高而降低，表明此吸附过程是一个放热过程，一定范围内低温有利于吸附，高温会抑制吸附，这对虫草素的进一步解吸提供思路。

图6 等温线的线性和非线性拟合曲线Fig.6 Linear fitting and nonlinear fitting curve of isotherm

3 结论

结果表明，虫草素在001×16的阳离子交换剂上吸附最优，且吸附等温线符合Langmuir 方程。001×16对虫草素的吸附受pH值的影响较大。其最佳的静态吸附工艺为溶液pH值为4.0，温度15 ℃，吸附时间3 h。在此条件下虫草素的吸附量可以达到1.296 33 mg/g。

研究发现，选择001×16阳离子吸附作为蛹虫草中的虫草素分离提纯的初步步骤，既提高了分离效率，又为虫草素进一步的解析提供了思路，同时为后续的进一步纯化提供了基础。

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