发芽大豆固态发酵功能红曲产Monacolin K工艺技术研究

黄 勋，王常苏，高泽鑫，高 冰*

（1.武汉生物工程学院 生物科学与技术系，湖北 武汉 430415；2.武汉轻工大学 生物与制药工程学院，湖北 武汉 430023；3.湖北工业大学 轻工学部，湖北 武汉 430068）

红曲霉作为发酵食品使用菌在我国已有上千年的使用历史，应用于食品着色和药用。自20世纪70年代末，日本ENDO A[1]发现红曲霉代谢产物中Monacolin K具有降胆固醇的功能，促进了红曲霉的研究与应用。红曲的次级代谢产物主要有红曲色素、Monacolin K、γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）、桔霉素（citrinin）等，前三者已证明其具有重要的生理活性功能。红曲色素作为食品着色剂广泛应用于肉制品、酿酒制醋等[2]。Monacolin K作为胆固醇合成抑制剂，能减少体内胆固醇的合成，调节人体内异常血脂以及治疗，是一种理想的降胆固醇和血脂药物[3-6]，此外Monacolin K还具有预防心脑血管疾病、抗肿瘤、预防老年痴呆和降低中风风险以及对肾脏免疫调节等作用[7-8]。陈运中等[9]通过动物试验证明了Monacolin K具有抗疲劳作用。GABA具有降血压和预防老年痴呆的生理作用[10]。

发芽黄豆因富含丰富的γ-氨基丁酸，并且大豆在发芽过程中脂肪、总糖含量降低，满足了人们对于低脂肪、低糖、高蛋白大豆的需求[11-13]，尤其是大豆发芽过程中一些功能性因子的生物合成和积累引起了人们关注，如大豆经适当的发芽，提高了大豆中异黄酮的含量[14]以及GABA的积累量。大豆异黄酮具有抗氧化、预防骨质疏松、预防心血管疾病以及抗癌等丰富的功能。GABA是一种非蛋白氨基酸，广泛分布于动物和植物体内，并具有多种人体的生理调节功能，是哺乳动物的神经系统的主要抑制性递质。此外，具有多功能的生理保健作用，对于其应用到产品的研发中是十分有价值的[15]。该文以发芽黄豆为主要原料，通过固态发酵优化产Monacolin K的工艺参数，以提高产品中Monacolin K的含量，同时提高了营养和保健功能。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

红色红曲菌（Monascus rubbervan Tieghem）、高产Monacolin K菌株M1、红曲霉（Monascus rubber）GIM3.439、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）Sce01：武汉轻工大学实验室保藏菌种。

1.1.2 培养基

红曲斜面培养基：12°Bx 麦芽汁琼脂培养基，pH自然。

固体发酵培养基：发芽黄豆100 g，葡萄糖5 g，蛋白胨3 g，NaNO30.45 g，ZnSO40.3 g，KH2PO40.1 g，MgSO40.1 g。

酵母液体培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂（potatodextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g，蔗糖20 g，水1 000 mL，pH自然。

发芽大豆培养基：发芽黄豆50 g，装入250 mL的三角瓶中，115 ℃，灭菌30 min。

麦芽汁斜面培养基：将麦芽粉碎后，按1∶4的比例加蒸馏水混合，63 ℃水浴加热4～5 h糖化水解，加碘液检测是否水解完全，4～6层纱布过滤，取滤液测糖度，加蒸馏水调至糖度为5～6，pH自然，加2.5%琼脂条后高压灭菌。

1.1.3 试剂

黄曲霉毒素B1、桔霉素（色谱纯）：澳大利亚Fermentek Ltd公司；甲酸（色谱级）、硼酸钠、乙腈、乙醇、磷酸二氢钾、磷酸二氢钾，均为分析纯：天津市科密欧化学试剂有限公司；洛伐他丁（色谱纯）：中国药品生物制品检验所；苯酚（分析纯）：天津市天力化学试剂有限公司；次氯酸钠溶液（分析纯）：天津市津北精细化工有限公司；冰醋酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；甲醇（色谱级）：江苏永华精细化学品有限公司；磷酸（分析纯）：天津市永大化学试剂有限公司；甲苯（色谱级）：江苏永华精细化学品有限公司。

1.2 仪器与设备

FW80高速万能粉碎机：郑州科丰仪器设备有限公司；40/100目分样筛：中国安平振兴筛具厂；WelchromTM 反相色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：大连依利特分析仪器有限公司；KQ2200DV型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；1100型高效液相色谱色谱仪：美国安捷伦公司；HHS型电热恒温水浴锅：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；LHS-250SC 型智能型恒温恒湿箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 酿酒酵母细胞破壁液制备工艺

用接种环从斜面培养基上接种已经培养18 h的酵母菌3环至50 mL PDA培养基中，在30 ℃和120 r/min培养18 h，然后将培养的酿酒酵母液经120 r/min离心、无菌水洗涤后，置于内有石英砂已灭菌研钵中研磨15 min，然后于12 000 r/min 离心1 min，所得上清液为酵母破壁液。

1.3.2 发芽大豆固态发酵功能红曲产Monacolin K工艺

（1）发酵的工艺流程图

（2）发酵培养的具体步骤

将保藏的红曲菌经平板活化后，接种于麦芽汁斜面培养基上，30 ℃培养6 d，分别用3 mL 0.2%无菌冰醋酸溶液洗脱斜面孢子，接种一定量的M1和GIM3.439的混合孢子液（1∶1，V/V）于发芽黄豆固体发酵培养基中，置于恒温恒湿培养箱内30 ℃培养6 d（其中在发酵的不同阶段分别接入酿酒酵母破壁液），再转入其他温度的恒温培养箱内培养15 d。待有微量菌丝长出后每隔12 h摇瓶，累积发酵完成后烘干，用高效液相色谱法检测Monacolin K含量。

1.3.3 发芽大豆固态发酵功能红曲产Monacolin K试验

（1）不同初始含水量对产Monacolin K的影响

采用固体发酵培养基，在基质发芽黄豆灭菌冷却后称质量，调节初始含水量分别为30%、35%、40%、45%、50%、55%，接种红曲菌M1发酵，发酵完成后检测Monacolin K含量。

（2）分段式温度培养对产Monacolin K的影响

采用固体发酵培养基，在其他发酵条件不改变的情况下，改变培养温度，先把菌株置于30 ℃恒温恒湿培养箱中进行培养，在培养6 d后，分别转入22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃培养箱中继续发酵15 d，发酵完成后检测Monacolin K含量。

（3）正交试验优化酿酒酵母破壁液对产Monacolin K的影响

在单因素试验基础上，根据陈璐等[16]的研究，通过对酿酒酵母破壁液的接种量、菌龄、接种时间设计L9（34）正交试验，确定最佳的发酵条件，因素水平见表1。

表1 添加酵母破壁液发酵条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for adding yeast wall-breaking liquid fermentation conditions optimization

1.3.4 功能成分分析

（1）Monacolin K含量测定

取发酵过筛处理后的样品0.5 g于离心管中，用3 mL甲醇溶液溶解，再800 W超声30 min，于40 ℃的恒温水浴锅中保温过夜。离心，取上清液进行HPLC检测。

HPLC检测条件：检测波长238 nm；流量1 mL/min；进样量20 μL；柱温25 ℃；流动相为甲醇/0.1%磷酸水=73∶27。

Monacolin K标准曲线绘制：取一定量的Monacolin K标准品溶于甲醇溶液，加入一定量物质的量浓度为0.1 mol/L的NaOH溶液，超声30 min后40 ℃水浴过夜，加磷酸溶液中和，甲醇定容至50 mL容量瓶得质量浓度为200 μg/mL的Monacolin K标准溶液，用甲醇稀释，配制质量浓度分别为5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL的标准溶液过0.45 μm滤膜待用。

（2）γ-氨基丁酸的测定

γ-氨基丁酸的检测采用GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》。

（3）桔霉素检测

样品处理：将在40 ℃干燥处理的豆豉粉研磨粉碎，过100目筛，取适量的豆豉粉溶于20 mL复合萃取剂（甲苯∶乙酸乙酯∶酸=7∶3∶1），超声20 min，3 000 r/min离心20 min，取上清液，沉淀物重复萃取两次，收集上清液，40 ℃真空浓缩至干，用30 mL甲醇溶解，过0.45 μm滤膜待用。

色谱条件：Welch公司反向色谱柱Welchrom-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温28 ℃；紫外检测波长254 nm；流动相为甲醇/水=55∶45，磷酸调pH 为4.0，流速为1.0 mL/min，进样量20 μL。

桔霉素标准曲线绘制：取桔霉素标准品1 mg，用甲醛溶液稀释成100 μg/mL，再分别配制质量浓度分别为5 μg/mL、10 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL的标准溶液，在波长254 nm处测定其吸光度值。

（4）黄曲霉毒素B1的测定

样品处理：取适量过筛后的红曲粉溶于8 mL复合萃取剂（乙腈∶水=21∶4），800 W超声提取20 min，3 000 r/min，20 min离心，取上清液，沉淀物重复萃取2次，收集上清液，40 ℃真空浓缩至干，用1 mL的流动相溶解，过0.45 μm滤膜待用。

色谱条件：反向色谱柱Welchrom-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温28 ℃；紫外检测波长365 nm；流动相为水∶甲醇∶乙腈=5∶4∶1，流速1.0 mL/min，进样量20 μL。

标准曲线绘制：取黄曲霉毒素B1标准品1 mg，用流动相定容至1 L，再配制质量浓度分别为0.5 μg/L、1 μg/L、2 μg/L、3 μg/L、4 μg/L、5 μg/L的标准溶液，在波长365 nm处测定吸光度值。

2 结果与分析

2.1 Monacolin K标准曲线的绘制

Monacolin K标准品经配制后得到不同质量浓度的标准品溶液。以峰面积积分值y为纵坐标，Monacolin K质量浓度x为横坐标，得到Monacolin K标准曲线回归方程为y=43.023x。试验表明Monacolin K在5～50 μg/mL范围具有良好的线性关系。

2.2 基质初始含水量的确定

初始含水量对Monaconlin K含量的影响见图1。由图1可知，随着基质含水量的增加，Monaconlin K含量的变化趋势呈现先增大后减小的趋势。在初始含水量为40%时，红曲发酵代谢产Monacolin K含量最高。适量的水分有利于红曲的生长，水分过低，物料干燥，菌丝生长较慢，水分过高，发酵后期游离水过多导致物料的黏液过多，均不利于功能性代谢产物的累积。因此选择最佳基质初始含水量为40%。

图1 初始水含量对Monaconlin K产量的影响Fig.1 Effect of initial water content on Monaconlin K production

2.3 分段培养温度的确定

发酵温度对Monacolin K含量的影响见图2。由图2可知，随着发酵温度的增加，Monaconlin K含量的变化趋势呈现先增大后减小的趋势。试验表明在接种红曲菌30 ℃恒温发酵的第6天，M1、GIM3.439菌株分别转入26 ℃恒温培养箱中，累积发酵后检测Monacolin K含量达到最高值。因此选择发酵温度为26 ℃。

图2 发酵温度对Monacolin K产量的影响Fig.2 Effect of fermentation temperature on Monaconlin K production

2.4 酿酒酵母破壁液对Monacolin K的影响正交试验结果

对酿酒酵母破壁液的接种量、菌龄、接入时间、温度设计L9（34）正交试验，确定最佳的发酵条件，结果与分析见表2，方差分析见表3。

表2 添加酵母菌破壁液正交试验结果及分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiment for adding yeast wall-breaking liquid fermentation conditions optimization

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of the orthogonal experiment result

由表2可知，4种因素对Monacolin K含量的影响次序为：添加量（A）＞菌龄（B）＞接入时间（C）＞温度（D）。分析正交试验结果得到的最优水平A3B3C2D3，即酵母菌培养40 h按3.0%的接种量接种到已接种红曲菌发酵3 d的基质中，在26 ℃的恒温培养箱中培养15 d。在此最佳条件下进行验证试验，Monacolin K产量为2.22 mg/g。由表3可知，接种量对试验结果的影响显著（P＜0.05），其他因素对试验结果的影响均不显著。

2.5 产品的功能性及安全性评价

2.5.1γ-氨基丁酸的检测分析

依据国家标准GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的测定》，采用全自动氨基酸分析仪进行分析，γ-氨基丁酸的含量达到16.18 mg/g。

2.5.2 桔霉素检测分析

以峰面积为纵坐标，桔霉素浓度为横坐标，绘制标准曲线，试验表明在5～50 μg/L范围具有良好的线性关系。通过检测发酵产品中桔霉素含量为0.10 mg/kg，按日本相关标准，在限量范围内。

2.5.3 黄曲霉毒素B1检测分析

以峰面积积分值为纵坐标，黄曲霉毒素B1质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。试验表明，在0.5～5.0 μg/L范围具有良好的线性关系。通过检测发酵产品中黄曲霉毒素B1含量为3.4 μg/kg，在国标限量范围内。

3 结论

以Monacolin K为指标，通过单因素和正交优化发酵工艺，得到最佳的发酵条件：采用经乳酸浸泡后，基质含水量为40%的发芽大豆，经灭菌冷却后，接种红曲M1和GIM3.439共同发酵，发酵3 d后，按3.0%的接种量接种已培养40 h的酵母种子液，在26 ℃的恒温培养箱中培养15 d，发酵产品中Monacolin K含量达到2.22 mg/g。原料经红曲霉、酿酒酵母和功能红曲发酵后，产品的色泽、风味非常好，干燥处理后香气浓郁。营养价值高，特别是γ-氨基丁酸的积累达到16.18 mg/g。通过检测发酵产品中桔霉素含量为0.10mg/kg，黄曲霉毒素B1含量为3.4 μg/kg，均在相关标准限量范围内。

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