太空搭载木聚糖酶高产菌株的选育

时间：2024-07-28

赵子高，王林风，闫德冉，杨付伟

（河南天冠企业集团有限公司，车用生物燃料技术国家重点实验室，河南南阳 473000）

太空诱变育种又称空间诱变育种，利用强辐射、微重力、高真空、弱磁场等宇宙空间特殊环境诱变因子的作用，使生物基因发生变异，再返回地面进行选育，培育新品种[1-2]。近年来我国航天育种发展迅速，作微生态制剂的乳酸菌、产维生素C的生黑醋酸杆菌、产泰乐菌素的由弗氏链霉菌、产谷氨酰胺转胺酶链霉菌、甘露聚糖酶产生菌、产超氧化物歧化酶的芽孢杆菌、产纤维素酶的里氏木霉菌等[3-8]经空间诱变后均在一定程度上获得了正突变株。研究将生产木聚糖酶的黑曲霉菌种搭载“神舟九号”宇宙飞船进行空间诱变育种，以期获得产酶能力大幅提高、性能稳定的突变株，应用于木聚糖酶的生产，降低纤维类原料在酶解过程物料黏度的同时促进半纤维素分解生成木糖等酵母可利用单糖，提高原料利用率，降低纤维乙醇生产成本。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种

黑曲霉菌株（Aspergillus niger）：由本研究室从生产中分离获得，CGMCC保藏号TG-Y。

1.1.2 培养基

斜面培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂1.8%。种子培养基：葡萄糖2%，麸皮1%。筛选培养基：葡萄糖0.5%，木聚糖1.0%，（NH4）2SO40.2%，MgSO40.05%，KH2PO40.1%，琼脂粉2.0%。发酵培养基：玉米芯4%，麸皮2%，（NH4）2SO40.5%，KH2PO40.3%，MgSO40.1%，聚乙二醇2000 0.05%，微量元素0.1%。

1.2 仪器与设备

UV1200型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；HY-211C恒温振荡器：上海智城分析仪器制造有限公司；TDM低速离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司；FE20pH计：上海梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SHA-C恒温振荡器：常州国华电气有限公司；LGJ-10D多岐管冷冻干燥机：北京四环科学仪器厂有限公司；50L全自动发酵罐：上海国强生化装备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 搭载材料准备[9]

根据“神舟九号”飞船的搭载条件和技术要求，按以下两种方式搭载，孢子悬液组TG-Y黑曲霉菌株以斜面培养基（PDA）培养72 h，用无菌水清洗过滤，离心洗涤后制成1×1010CFU/mL孢子悬液（SP1），搭载。对照组（CK）为上述孢子悬液，不搭载。孢子粉组（SP2）TG-Y黑曲霉菌株以斜面培养基（PDA）培养72 h，用无菌水清洗过滤，离心洗涤后，以灭菌后20%脱脂牛奶制备悬液，冻干，搭载。对照组（CK）为上述冻干粉，不搭载。

1.3.2 搭载过程

搭载实验菌株的神州九号宇宙飞船于2012年6月16日在酒泉卫星发射场，通过长征二号F遥九火箭发射升空，2012年6月29日，神舟九号飞船返回舱成功降落在位于内蒙古中部的主着陆场预定区域，2012年7月5日，样品送回河南天冠企业集团。

1.3.3 诱变菌株培养

“神舟九号”飞船搭载菌种返回后，将各搭载组的试管中孢子用无菌生理盐水洗出，离心洗涤3次，将所得孢子进行适当稀释后涂布于PDA培养基平板，30 ℃培养36～48 h，观察生长菌落的形态状况，并计算未搭载菌株与搭载菌株的存活率和形态突变率，存活率和形态突变率计算公式如下：

1.3.4 高产突变株筛选

采用透明圈法[10]初筛，初步淘汰低产酶菌株，并在PDA培养基上将初步筛选出的高产空间诱变株进行4、5代传代培养。将初步筛选出的菌株转接至PDA培养基，培养96 h后，制成2×107CFU/mL孢子悬液，接种于发酵培养基进行复筛，测定酶活力。摇瓶实验将孢子悬液以10%接种量接种于50 mL/250 mL三角瓶中，30 ℃、210 r/min条件下培养96 h，测定木聚糖酶活力。

1.3.5 酶活力测定

参照杨付伟等[11-12]木聚糖酶活力测定方法，略有改动。

1.3.6 遗传稳定性实验

在PDA培养基上将复筛所得到的产酶突变株每半月进行1次的传代培养，连续传代7～8代，并摇瓶发酵测定酶活力。

1.3.7 放大实验

通过50 L全自动发酵罐进行产酶放大实验。

2 结果与分析

2.1 空间诱变对黑曲霉形态的影响

黑曲霉经空间搭载后，形态及存活率均发生了一定的变化，结果见表1。

表1 搭载后黑曲霉菌株存活率及形态突变率Table 1 Survival rate and morphology mutation ratio of Aspergillus niger loaded in spacecraft

由表1可知，与未搭载对照菌株的白色、由同心环向边缘呈辐射状的外观比较，经搭载处理的菌株形态表现为四类：（1）菌落大，边缘不整齐，孢子量大。（2）菌落极小，边缘整齐，孢子浅灰色，孢子量少。（3）菌落清晰，边缘整齐，孢子丰富，松散，黑色。（4）菌落浅褐色，边缘不整齐，孢子极少。SP1组形态突变率达到14.6%；SP2组形态突变率为5.4%，存活率达75.80%，这与冻干孢子处于休眠状态在空间环境下不易发生变异有关。

2.2 空间诱变后产酶黑曲霉菌株的筛选

2.2.1 菌株筛选

利用产酶菌株能在含有低聚木糖的平板上形成透明圈，且透明圈/菌落直径比值大小大致反映菌株产酶能力的高低，采用木聚糖琼脂培养基平板从分离得到的1 500株产酶菌种初筛到10株分解木聚糖菌株，从SP1组筛选到4株，SP2组筛选到6株。

对初筛到的编号为SP1-057、SP1-191、SP1-268、SP1-523、SP2-145、SP2-336、SP2-582、SP2-651、SP1-752、SP2-801 菌株进行复筛，连续进行3批次摇瓶发酵实验，结果如图1所示。

图1 10菌株3批次发酵结果Fig.1 Fermentation results of 10 strains in shake flasks for 3 batches

依据图1 发酵结果选择产酶活力较高且3批次酶活力变化波动不大的SP1-523、SP2-145、SP2-582、SP1-752、SP2-801这5株菌进行多点发酵实验以进一步确定优良菌株。

2.2.2 多点发酵实验结果

实验进行3批次，每批次取样时间点为48h、72 h、84 h、96 h各测定一次酶活力，结果如表2所示。

表2 5种菌株发酵结果Table 2 Fermentation results of 5 strains at different time

由表2可知，SP1-523、SP2-801菌株发酵过程酶活力增加平稳，单位时间内酶活力增加幅度较大，两者均有明显的发酵优势，对两者进行多次传代培养验证其遗传稳定性。

2.2.3 遗传稳定性

生产菌株往往存在随着传代次数的增加，菌株发生退化，导致其发酵能力降低，对于诱变菌株更易出现回复突变使其诱变性状发生改变，因此对复筛到的SP1-523、SP2-801菌株进行7次传代培养，考察其遗传稳定性，结果如表3所示。

表3 遗传稳定性实验结果Table 3 Results of hereditary stability

由表3 可知，SP1-523、SP2-801菌株经多次传代后，发酵性能稳定，酶活力维持在（2 000±50）IU/mL，可见经空间诱变筛选到的SP1-523、SP2-801菌株，酶活力提高20%，且具有良好的遗传稳定性。

2.2.4 放大实验

对SP1-523、SP2-801菌株进行50 L罐放大实验，各自进行五批次发酵实验，发酵周期120 h，酶活力结果如表4所示。

表4 菌株五批次发酵放大实验结果Table 4 Results of strains scale-up experiment for 5 batches

由表4可知，经五批次发酵放大实验，SP1-523、SP2-801两菌株，发酵周期120 h，酶活力均达（2 500±50）IU/mL，与对照比酶活力提高达25%左右，可见两菌株发酵性能稳定，具有高酶活力特性，可用于生产中进行放大实验。

3 结论

随着我国航天工业的飞速发展，利用太空诱变获得具有优良性状的微生物菌株亦成为微生物诱变育种主要手段之一[13-16]，实验中经空间诱变后的黑曲霉菌株其形态和产酶能力均发生了不同程度的变化，通过多轮初筛、复筛获得的SP1-523、SP2-801菌株具有高产木聚糖酶的能力，与出发菌株比，酶活力提高20%以上，且遗传性能稳定，易于培养，经50 L罐放大实验验证，发酵水平可提高25%，具备作为工业微生物的条件，可作为规模化生产木聚糖酶的生产菌株使用，经60 m3发酵罐放大实验，酶活力水平提高达30%；该菌株应用于生产后，在不增加投资成本的情况下可大幅降低单位酶生产成本达25%，从而降低纤维乙醇生产中酶的应用成本，在推动纤维乙醇产业化的同时，相关酶制剂产品亦可应用于食品、饲料、饮料、造纸等多个领域，目前正通过基因工程技术手段对SP1-523、SP2-801菌株DNA序列多态性等进行研究。

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