高效液相色谱-质谱联用测定婴幼儿配方食品中叶酸的含量

竺 琴，苏流坤，王 飞，农云军，石燕丽，梁迪思

（中国广州分析测试中心 广州化学危险应急检测技术重点实验室，广东 广州 510070）

叶酸是由碟啶、对氨基苯甲酸和数量不等的酪氨酸等三部分组成，是一种重要的B族维生素，参与核酸、蛋白质的生物合成，与许多重要的生化过程密切相关。虽然叶酸天然的存在于部分食物当中，但是其含量低，并多以多谷氨酸的形式存在，不能满足人体需求，所以从20世纪90年代初期人们逐渐将叶酸作为添加剂适量的添加在一些强化食品和保健品中。叶酸对于孕妇和婴幼儿有特殊的重要性，因此在其使用的食物中添加叶酸显得尤为重要，GB 10765—2010《婴幼儿配方食品》中规定了叶酸作为婴儿配方食品添加物[1]，因此，准确的测定叶酸的含量对产品的生产加工、功效评价等有重要的意义。

目前，国家标准GB/T 5009.211—2008《食品中叶酸的测定》和GB 5413.16—2010《婴幼儿配方食品和乳品中叶酸（叶酸盐活性）测定》中对食品和婴儿食品和乳制品中叶酸的测定采样微生物法[2-3]，此方法周期长，步骤繁琐，重复性差，影响因素多。国内外文献中检测叶酸含量多采样紫外分光光度法、荧光法、液相色谱法（liquid chromatography，LC）、液相色谱荧光法、气质联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）和高效液相色谱质谱联用等方法[4-10]，在婴幼儿配方食品中，特别是乳制品，叶酸的含量低、基质复杂、干扰大，难准确测定，本实验建立了高效液相色谱质谱联用测定婴幼儿配方食品中叶酸的方法，作为叶酸测定国标方法的补充，其适应范围广、分析时间短、灵敏度高，为婴幼儿配方食品中叶酸的测定提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

8种婴幼儿配方食品（包括奶粉、米粉、多维片等）：市售。叶酸对照品、胰蛋白酶（12 000 U/g）：美国Sigma-Aldrich公司；盐酸（分析纯）、乙酸（分析纯）、乙酸铵（分析纯）、三氯乙酸（分析纯）：广州化学试剂厂；甲酸（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、乙醇（色谱纯）：美国霍尼韦尔公司；水为二次蒸馏水。

1.2 仪器与设备

1100LC-Trap-XCT高效液相色谱-离子阱质谱系统（配有电喷雾离子源及Agilent Chem Stations数据处理软件）：美国安捷伦公司；Sartorius BP61型电子天平（0.1 mg）：德国Sartorius公司；KQ-600E型超声波清洗仪：昆山市超声仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 高效液相色谱条件

色谱柱C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相A：5 mmol/L乙酸铵（含0.1%甲酸）溶液，流动相B：甲醇；梯度：B相10%，8 min；B相55%，8.1 min；B相10%，15.0 min；流速：1.0 mL/min；柱温：25℃；进样量：20μL；采样柱后分流，分流比为1∶3（V/V）。

1.3.2 质谱条件

电喷雾离子源（electrospray ionization，ESI）：正离子模式；毛细管电压5.0 kV，毛细管出口电压109.4 V，雾化气压力：3.50×105Pa，干燥气流速：10 L/min，干燥气温度：350 ℃，扫描方式：多离子监测（multiple reaction monitoring，MRM），定量离子442.0→295.2。

1.3.3 标准溶液配制

准确称取叶酸对照品0.1 g（精确到0.1 mg），加入2.5 mL 5%的Na2CO3，用蒸馏水溶解定容至100 mL，得到质量浓度为1.00 g/L的叶酸储备液。储备液用蒸馏水稀释成系列对照液供分析用。

1.3.4 样品前处理

称样：将样品混匀，准确称取样品5.0 g（精确到0.1 mg），加入0.5 g抗坏血酸，加入2.5 mL 5%Na2CO3，加入适量蒸馏水，超声20 min。

脱脂和去蛋白：加入20 mL 0.1 mol/L HCl定容至100 mL（无脂和蛋白样品不做此步骤），用蒸馏水定容至50.0 mL，再以3 500 r/min离心10 min，过滤，取清液1～2 mL过0.45 μm滤膜，进行液相色谱-质谱分析。

2 结果与分析

2.1 样品前处理的讨论

叶酸稳定性差，对热、光线、酸性环境不稳定，但叶酸在中性偏碱条件下比较稳定，并且还原剂抗坏血酸对叶酸的稳定性有明显的保护作用[11]，因此在提取过程中添加抗坏血酸和Na2CO3溶液减少叶酸在检测过程中的损失。叶酸为水溶性维生素，因此用水超声浸提可达到满意的提取效果，但是婴儿配方奶粉中的成分复杂，奶粉中的蛋白质等大分子化合物也会影响叶酸提取效率和色谱分离效果，因此适合的前处理显得尤为重要，本实验比较了乙腈（15 mL）、乙醇（15 mL）、乙酸（20 mL）、0.1 mol/L盐酸（20 mL）、1%三氯乙酸（20 mL）、3%高氯酸（20 mL）5种试剂[12-13]及120 U/g胰蛋白酶液（20 mL）对蛋白的沉淀效果，结果见表1。

由表1可知，乙腈、乙醇和蛋白酶的去蛋白效果也很好，但是在去蛋白过程中叶酸损失较大，综合考虑最终选择0.1 mol/L HCl 20 mL处理样品。

2.2 LC-MS条件的讨论

[14-15]，采C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，以5 mmol/L乙酸铵和甲醇作为流动相，进行梯度洗脱，叶酸的保留时间适中且峰形佳，适合定量分析。图1为叶酸提取离子色谱图（extracted ion chromatogram，EIC）。叶酸在电喷雾正离子模式下产生[M+H]+，选择[M+H]+进行产物离子扫描产生的主要碎片离子为m/z 442.0→295.2，将m/z 295.2碎片离子作为定量离子。

图1 标准品(A)和样品(B)的叶酸提取离子色谱图Fig.1 LC-MS chromatograms of folic acid for standard solution (A)and sample (B)

2.3 检出限和定量限

取储备液逐级稀释，经0.45 μm滤膜过滤后按照高效液相色谱和质谱条件进行分析，进样量为20 μL。以信噪比S/N=3计算叶酸的检出限（limit of detection，LOD），信噪比S/N=10计算其定量限（limit of quantitation，LOQ），通过计算得到叶酸的LOD为1.0 ng/mL，LOQ为3.3 ng/mL。

2.4 标准曲线与线性范围

取叶酸储备液逐级稀释成质量浓度为0.001 μg/mL、0.025 μg/mL、0.100 μg/mL、0.500 μg/mL、1.000 μg/mL、2.500 μg/mL的标准溶液。以标准溶液的峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X）为横坐标绘制标准曲线，结果见图2。

由图2可知，标准曲线线性方程为Y=976 8.3X-11.0，相关系数r=0.998 9，结果表明，叶酸在0.001～2.500 μg/mL的范围内，叶酸的质量浓度和峰面积的线性关系良好，适合作为定量分析。

2.5 精密度和回收率实验

图2 叶酸的标准曲线Fig.2 Standard curve of folic acid

分别取市售8种不同的婴幼儿配方食品（包括奶粉、米粉、多维片等），按照本方法测定其中叶酸的本底含量，每个样品平行测定6次，计算其相对标准偏差。向样品中分别加入10.0 μg、30.0 μg、100 μg的标准品，计算其加标回收率，结果见表2。

表2 叶酸的精密度和回收率实验结果(n=6)Table 2 Results of precision and recovery experiment of folic acid (n=6)

由表2可知，叶酸检测的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为2.6%～6.0%，加标回收率为83.9%～104.0%。方法显示了较好的准确度和重复性，能满足实际样品的分析要求。

3 结论

实验采用高效液相液相色谱-质谱联用（LC-MS）的方法，对婴幼儿配方食品的叶酸进行测定。婴幼儿配方食品中特别是奶制品中，叶酸的添加量低，并且样品基质复杂，利用质谱的高选择性和液相色谱的强分离能力，避免了样品中杂质的干扰、分析时间长等问题，简化了操作步骤、缩短实验周期。根据该方法对市场上的8种婴儿配方食品进行定量分析，在0.001～2.500 μg/mL的范围内线性关系良好（r=0.998 9），相对标准偏差RSD为2.6%～6.0%，回收率为83.9%～104.0%，检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分别为1.0 ng/mL、3.3 ng/mL，结果显示该方法适用于婴幼儿配方食品中叶酸的测定。该方法采用专属性强的质谱检测器，灵敏度高，并联用色谱分离方法，可以进行具有较复杂基质、叶酸含量低的食品中叶酸的检测。

参考文献：

[1]国家质量监督检验检疫总局.GB 10765—2010 婴儿配方食品[S].北京：中国标准出版社，2010.

[2]国家质量监督检验检疫总局.GB/T 5009.211—2008 食品中叶酸的测定[S].北京：中国标准出版社，2008.

[3]国家质量监督检验检疫总局.GB 5413.16—2010 婴幼儿食品和乳品中叶酸的测定[S].北京：中国标准出版社，2010.

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