气相色谱-串联质谱法同时测定肉制品中氯霉素、甲砜霉素残留

时间：2024-07-28

高洁

（国贸食品科学研究所，北京 100070）

氯霉素（choloramphenicol，CAP）是一种广谱抗菌药物[1-2]，曾经广泛应用于人体和各种动物疾病的治疗和预防[3-4]，但是近期人们逐渐发现氯霉素在动物体内残留量很大，人一旦长期食用含有氯霉素残留的动物产品就会对人体健康造成极大的威胁，严重者引起再生障碍贫血和灰婴综合症[5]，甚至危及生命。因此国家农业部把其列为禁止用于食品动物的抗生素[6]。甲砜霉素（thiamphenicol，TAP）是一种氯霉素类药物，目前也用于人和动物，存在滥用的风险，因此有必要对其进行监控。

氯霉素及其同类物质的检测方法有很多，如酶联免疫法[7-8]、气相色谱法[9]、胶体金免疫层析法[10]、液相色谱法[11-12]、电化学法[13]，但是实验室中较为常用的还是液相色谱-串联质谱法[14-15]和气相色谱-质谱联用法[16]。本试验采用负化学电离源气相色谱-串联质谱法检测肉制品中的氯霉素与甲砜霉素，与单极质谱相比，降低了基线，增大了检测信号的信噪比，提高了灵敏度。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

甲醇（色谱纯）、甲苯、正己烷（农残级），乙酸乙酯、乙醚、氯化钠（分析纯）、氯霉素甲砜霉素标准品、间氯霉素标准品：比利时Acros公司。

衍生化试剂：N，O双（三甲基硅基）三氟乙酰胺-三甲基氯硅烷（BSTFA+TMCS，99+1）：美国REGIS公司。

固相萃取柱：弗罗里硅土柱（6.0 mL，1 g）：北京振翔贸易有限公司。

1.2 仪器与设备

Varian450GC/320MS配有化学电离（chemical ionization，CI）源：美国瓦里安有限公司；HR2095组织捣碎机：荷兰皇家飞利浦公司；固相萃取装置：北京振翔科技有限公司；R-3型旋转蒸发仪：瑞士步琪有限公司；KQ-500DB型数控超声波清洗器：昆山舒美超声仪器有限公司；LC-212恒温箱：广东宏展科技有限公司；DSY-Ⅲ氮吹仪：苏州奇乐电子科技有限公司；CS-H1涡旋混合器：南京东迈科技仪器有限公司；TDL-5-A离心机：上海安亭科学仪器公司。

1.3 实验方法[21]

1.3.1 样品处理方法

称取5 g粉碎的肉制品于50 mL具塞离心管中，加入0.5 μg/mL内标10 μL和30 mL乙酸乙酯离心取上清液，再提取一次合并提取液，35 ℃旋转蒸发至1～2 mL，待净化。正己烷液-液萃取，弃去正己烷层，水相用40 mL乙酸乙酯分两次提取，合并乙酸乙酯相于心形瓶中，35 ℃旋转蒸发至近干，氮气吹干。弗罗里硅土柱依次用5 mL甲醇、5 mL甲醇-乙醚（3+7）和5 mL乙醚淋洗备用。将前述残渣用5 mL乙醚溶解上样，用5 mL乙醚淋洗，5 mL甲醇-乙醚（3+7）洗脱，洗脱液用氮气吹干。净化后的试样用0.2 mL甲苯溶解，加入0.1 mL衍生化试剂混合，于70 ℃衍生60 min。氮气吹干，用1.0 mL正己烷定容，待测定。

1.3.2 色谱条件[17]

VF-5MS色谱柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm；50 ℃保持1 min，以25 ℃/min程序升温至280 ℃，保持5 min；自动进样器，无分流进样1 μL，载气：氦气；离子源：200 ℃，负离子化学源（negative chemical ionization，NCI）模式，反应气为甲烷，压力800 Pa，电子能量70 eV，扫描方式为多离子监测模式。氯霉素选择母离子为m/e466，监控子离子为m/e304和m/e322；甲砜霉素选择母离子为m/e499，监控子离子为m/e355与265。碰撞诱导解离（collision induced dissociation，CID）气压：氩气0.239 Pa。

1.4 计算公式

样品中氯霉素与甲砜霉素的含量（X）按下式计算：

注：X为样品中氯霉素与甲砜霉素含量，μg/kg；C为试样中氯霉素与甲砜霉质量浓度，μg/L；V为试样最终定容体积，mL；m为样品质量，g。

2 结果与分析

2.1 二级质谱条件优化

2.1.1 母离子选择

在一级质谱条件下氯霉素的主要离子有m/e466、468、376、378，甲砜霉素的主要离子有m/e409、411、499、501。其中氯霉素的m/e466离子响应最大，甲砜霉素m/e499离子响应最大，因此选择这两个离子分别作为两种物质的母离子。

2.1.2 子离子选择

分别以m/e466和m/e499离子为母离子，固定CID气压0.239 Pa，在不同电压条件下扫描质荷比100～500范围内两种母离子的子离子碎片，结果分别如图1与图2所示。

从图1、图2可以看出，氯霉素响应最大的两个子离子为m/e322与m/e304，甲砜霉素响应最大的两个离子为m/e355与m/e265。

图1 氯霉素子离子选择Fig.1 Selection of ions for chloramphenicol

图2 甲砜霉素子离子选择Fig.2 Selection of ions for thiamphenicol

2.1.3 碰撞电压优化

固定氯霉素与甲砜霉素的母离子与子离子，改变碰撞电压，记录离子响应强度，结果如图3所示。从图3可以看出，466-304离子对最佳碰撞电压为6 V，466-322离子对最佳碰撞电压为5 V，499-355离子对最佳碰撞电压为6 V，499-265离子对最佳碰撞电压为7 V。

2.2 灵敏度比较

取不含目标化合物的阴性样品加标氯霉素与甲砜霉素各10 ng后进行检测，一级质谱与二级质谱定量离子的信噪比如表1所示，谱图比较如图4所示。由表1、图4可以看出，采用二级质谱后信噪比明显提高从而提高了检测灵敏度。

图4 一级质谱与二级质谱灵敏度比较Fig.4 Sensitivity of MS and MS/MS

2.3 标准曲线与检出限

将处理好的梯度浓度标液依次进样，以标样峰面积与内标峰面积之比对标样与内标浓度之比作图，得到工作曲线，氯霉素：y=0.975 9x-0.063 3，r2=0.992 5；甲砜霉素：y=3.581 5x+0.072 9，r2=0.997 3，检出限为：氯霉素0.02 μg/kg，甲砜霉素0.1 μg/kg。