微生物发酵制药技术

时间：2024-07-28

白立勇，葛新霞，王建华

（山东省医药工业设计院，山东济南 250000）

1 微生物发酵概述

1.1 概念

微生物发酵就是给微生物提供适宜生存的环境，通过微生物来对材料的性质进行改变，并最终获得目标产物的过程。在这一过程中，影响产物的主要因素包括原料、菌种和环境，不同的原料和不同的菌种，在不同的环境下会产生不同的东西，当然，在发酵过程中，由于生产环境的变化，很可能不会产生目标产物，甚至产生一些有毒有害的产物，这就需要对发酵环境进行精确控制。在现代制药工程中，很多发酵过程生产单额药品，都是初级代谢产物或副产物，这对发酵控制就有更严格的要求，工艺难度也更大。

1.2 应用

目前，该技术在很多领域都有所应用，比如说食品行业，最常见的就是酿酒和酸奶，日常生活中蒸馒头的过程，实质上也是一种微生物发酵的过程。在化工领域，更多的是生产农药，比如生物农药和杀虫剂等。在医药领域，该技术的出现可以说救了无数人的生命，在二次世界大战爆发的时候，青霉素通过该技术实现了工业化生产，现如今的抗生素、氨基酸等很多药物，也是通过该技术工艺实现的。但由于该生产的过程是微生物自发进行的，所以在制药领域如何更精准地控制微生物，把握发酵的进程，并回收需要的产物，成为技术发展的核心与关键。

2 细胞培养微载体的类型

2.1 经典型细胞培养微载体

首先是电荷型光面微载体，该载体研发的时间为1967年，使用DEAE-Sepha-dexA50凝胶，用DEAE-Sepha-dexA50凝胶当做培养细胞的载体物质，该凝胶已经经过N，N-二乙基乙醇氨的处理，所以其表面十分光滑，在处理之后其自身所携带的正电荷数值约为3.5meq/g，利用电荷相互吸引的特质，使得细胞都可以较好地吸附并黏贴在微载体物质的表面上。电荷型光面微载体已经成为了当前GE 公司较为经典的一类细胞微载体产品。我国相关学者开展了Cytodex1微载体的一系列研究工作，针对该微载体的利用率以及最高细胞密度数值等进行了探究。经过实验证明，若微载体的浓度提升，那么其最大细胞的密度就会呈现出下降的趋势，在3g/L 时的用量，其状态最佳，不管是细胞贴壁的面积还是微载体的利用率数值都比较高。Cytodex1 微载体并不会存在动物源的组成成分，所以其微载体的生物性能比较好，安全性也比较强。和其相关的细胞生长技术的操作性也比较强，可以大致满足相应的动物细胞规模培养标准要求。其次是胶原包被型微载体，Cytodex1细胞实际的适用范围相对来说会比较广泛，但是其并不适用于一些表面黏附以及功能性低下的细胞，若将该微载体应用到其类型的细胞内，那么其细胞的附着率极为低下，且各类细胞的生长速度也比较慢，细胞凋亡的现象比较明显，细胞很容易产生脱落等的问题。想要构建出一种生物相容性比较强的细胞附着表面，就需要借助猪皮Ⅰ型胶原蛋白，采取共价连接的形式，让其交联在Sephadex 微球表面上，开发Cytodex3及同类包被胶原覆层等的微载体类型，对Cytodex3进行细胞支架的研究，分析上皮细胞以及上皮性疾病的题外细胞培养模型。

2.2 酶解型细胞微载体

首先是明胶或胶原微载体，在培养经典型细胞微载体时，其总体细胞分离的工序十分复杂，且消化过程的把控难度也较高。微载体主要是将明胶和疏水性矿物油整合在一起，使用搅拌混合的形式，同时进行NaBH4的还原处理，让其生成淡黄色的明胶微载体。该类型的微载体是一种非刚性球的物质，且其生物的相容性也较强，可以完全性溶解明胶物质，细胞的分离以及收获十分的简便。在进行多类细胞培养分析工作，可以使得细胞载体更好的分离。其次是生物降解型微载体，当前，人们开始借助聚乳酸、壳聚糖等物质进行干细胞的培养工作，在细胞支架注入到机体之后，可以直接被降解以及吸收，极大程度地给我国制药的应用提供了便利。

3 细胞培养微载体在制药的应用

3.1 蛋白质药物与疫苗研究

首先是蛋白质药物的研究，微载体细胞培养技术种类丰富，且相关的工艺模式也十分的灵活，要科学合理地选择使用灌注、流加等各项工艺技术，同时还需要尽可能地满足药物生产的各类实际性需求，使得蛋白药物的研发工作可以进展得更为顺畅，其在我国生产领域中的应用范围也开始逐渐的变广。细胞微载体培养技术主要被应用到蛋白药物的生产以及研发工作中，相关的药物种类也比较繁杂，各项工艺技术也较为成熟。微载体培养工艺技术的使用会在提升单抗产量的过程中，让其糖基化水平趋于稳定，保障了单抗的品质。其次是病毒培养与疫苗研究，细胞微载体培养技术在我国病毒培养以及疫苗领域研究的发展速度相对来说较快，一些公司会使用微载体培养技术培养Vero 细胞生产禽流感疫苗，其生产的规模已经扩大到6 000L。

3.2 干细胞培养及组织工程

首先是干细胞的培养，干细胞的分离以及大规模化培养始终是制药事业发展的核心，采取体外分离技术所获得的干细胞数量相对来说较少，存在一定的约束限制，根本无法满足当前我国临床的实际性需求。以往的干细胞单层培养工作中，其传代次数逐渐的提升，培养的时间也逐渐延长，这就使得干细胞逐渐的丧失了一定的自我更新能力，同时还让其朝向多向分化潜能等的特征发展。细胞微载体培养技术的应用不但可以让细胞基质维持相应的均一性，同时还可以使得细胞在较短的时间范围内进行高密度的生长，让干细胞进行体外大规模的培养。其次是组织工程，在组织工程学当中，微载体主要应用到种子细胞大规模性的扩增项目中，让其作为细胞转运以及传递的重要支架，可以不断地放大组织过程，同时满足当前我国制药日益增长的临床需求。

4 微生物发酵制药种类

4.1 菌体发酵

菌体发酵是最传统的一种发酵方式，这种发酵所得到的药物，在古代就已经被应用，比2细胞培养微载体在生物医学的应用

如说冬虫夏草、茯苓等，都是菌体发酵得到的产物。菌体发酵最大的特点就是过程控制比较容易，一般来说产物的生产速度，与发酵速率是成正比的，即产物获得最大的时期，就是发酵速度最快的时候，因此在生产中关键就在于控制好发酵环境，如果能够保证环境的相对恒定，那产物合成率就会更高，经济效益也会更好。

4.2 酶发酵

青霉素就是酶发酵的产物，在现代的制药体系中，酶发酵已经成为重要的技术，不仅生产出很多救人性命的抗生素，还发明出很多重要的药品。比如说抗癌的天冬酰胺酶、治疗血栓的纳豆激酶等。因为酶发酵的产物很多都具有特殊的药用功能，因此该技术制药的研发已经成为生物制药发展的主流方向之一。在该技术中，发酵过程是利用诱导或抑制剂，从而生产出特定发酵产物实现的，这意味着需要在发酵过程中进行更多的控制和干预。为了提高产量，对于菌种的选育、培养基的配制和发酵条件的控制方面，就更为严格。

4.3 代谢产物发酵

代谢产物就是伴随着菌种生长产生的产物，这种产物在发酵过程中一般来说生产比较少，但通过人工的干预，产量也能够有显著的提高。生活中经常见到的氨基酸、核苷酸、维生素等药品，正是代谢发酵得到的。由于代谢发酵需要的产物是与发酵产物掺杂在一起的，所以工艺的难点就在于收集和分离，当然为了提高产量，通过有效的手段也能提高代谢产物的得率。

4.4 转化发酵

生物发酵是一种利用微生物将原料转化为产物的过程，转化发酵正是精准的实现这一过程的一种方法。通过加入多种酶，能够实现对化合物的目的性加工，从而得到我们想要的具有药用价值的化学结构。用于降低身体排异反应的可的松，正是采用该方法生产的。当然除了该药品，很多独特作用的激素类药品都是采用该技术，该技术相比于传统的技术，是生物发酵更深化的发展，是现代科技和制药技术的结晶。

5 应用与实践

5.1 培养基

培养基就好比是微生物的温床，是给微生物成长繁殖用的，培养基中需要根据菌种的培养需求提供配制的营养物质。为了保证能够生成目标产物，培养基还必须满足无菌的要求，一般来说培养基分为固体培养基、液体培养基、合成培养基等。不同种类的培养基，适用的培养环境不同，适用的菌种也不同，因此在制药生产中，一定要根据需求选择。

5.2 菌种制备

菌种，决定了培养过后能够得到什么，菌种的优劣，也影响了产物的产率。因此在制药工程中，菌种的制备和选择，同样是重点工作。一般来说，菌种需要在实验室条件下进行选育、发酵实验成功后，才能被应用于生产。由于菌种在发展中也会产生品质的变化，这微小的变化是更微观的体现，是看不见摸不到的，所以对于一条工艺上常用的菌种，为了保证其代代活性不变，还需要进行定期的纯化和再次育种。

5.3 种子培养

种子培养是一种由少变多的过程，通常来说，是先在实验室或小型设备上进行小规模的培养，待培养成熟后，活性达标后，将种子移植到大型发酵罐中，给予所需的环境和营养物质，在一定周期后实现种群的扩大，最终获得需要的产物。在种子培养和扩大过程中，最容易发生的就是污染，一旦任何流程中被污染，那必然会造成损失，如果不能及时发现，甚至会导致这一次生产完全性的失败，因此对无菌操作环境的要求极高。除此之外，还需要控制好环境，只有合适的环境，菌群才能扩散生长，因此就要做好培养环境的打造，确保发酵罐能够得到稳定的温度控制。

5.4 发酵

种子扩散后，需要经过发酵才能得到所需要的药品，发酵过程实质上就是种子繁殖生长的过程，在这一过程中关键要素就是要保证环境无菌和恒定。因此，任何一批发酵生产过程都是独立的，即在生产前和生产后，需要进行彻底的蒸汽灭菌，以确保发酵环境的无菌。如果发酵过程需要进行控制，需要添加其他物质，也要求全部进行无菌操作。最好能够实现自动化操作，避免人工操作带来的不利影响。