高效液相色谱法检测药品糖浆剂中4种人工合成甜味剂

钟菲菲 雷德卿 周金沙 刘 波 王子倩

(长沙市食品药品检验所，湖南 长沙 410008)

人工合成甜味剂是一类应用较广泛的食品添加剂，主要有糖精钠、安赛蜜、阿斯巴甜、爱德万甜、甜蜜素、三氯蔗糖等[1]。过量摄入人工合成甜味剂可能损害人的肝脏、神经、消化系统，甚至引发癌症[2-4]，婴幼儿更容易受到不可逆损伤[5]。

食品中人工合成甜味剂检测手段较多[4,6]，主要有毛细管电泳法[7]、离子色谱法[8]、气相色谱法[9]、高效液相色谱法[10-13]、高效液相色谱-质谱联用法[14-16]等。毛细管电泳法及离子色谱法灵敏度低，重现性差，易受样品中其他组分干扰；气相色谱法通常需要柱前衍生化，操作较繁琐；高效液相色谱—质谱法仪器昂贵，且受样品基质影响明显。目前食品国家安全标准主要是检测单组分的甜味剂，往往一个方法适用于一种组分，同时检测多种非法添加食品甜味剂的方法尚未见诸于报道。因此，亟需建立一种准确简单的方法同时测定多种人工合成甜味剂。

小儿止咳糖浆以药食同源的甘草和桔梗等为原料，处方中蔗糖含量为65 g/100 mL[17]。但药用辅料蔗糖来源于天然产物，价格昂贵，因此一些商家为降低成本使用糖精钠等人工合成甜味剂替代蔗糖。研究拟以小儿止咳糖浆为例，在探索前处理方法的基础上，建立高效液相色谱法同时测定药品糖浆剂中安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜、爱德万甜4种食品甜味剂，以期为食品甜味剂安全研究和风险评估提供参考，为科学监管提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

乙腈：色谱纯，批号JA110130，美国默克公司；

甲醇：色谱纯，批号L1147507 117，德国默克公司；

超纯水：自制并经检测符合规定；

小儿止咳糖浆样品：来源于21家生产企业共45批次；

安赛蜜标准品：纯度99.4%，批号G1012337，德国Dr. Ehrenstorfer公司；

糖精钠标准品：纯度86.2%，批号510208-202001，德国Dr. Ehrenstorfer公司；

阿斯巴甜标准品：纯度95.0%，批号510206-202001，德国Dr. Ehrenstorfer公司；

爱德万甜标准品：纯度97.0%，批号102278222，德国Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 主要仪器设备

高效液相色谱仪：Waters alliance e2695型，美国Waters公司；

电子分析天平：METTLER XS205DU型，瑞士梅特勒—托利多公司；

纯化水系统：Millipore Milli-Q Direct 8型，美国密理博公司。

1.3 方法

1.3.1 液相色谱条件 色谱柱为Shiseido AQ-C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，以乙腈为流动相A，以0.02 mol/L磷酸二氢铵(用三乙胺调节pH值至5.5)为流动相B，梯度洗脱(洗脱程序：0 min，2% A，98% B；10 min，5% A，95% B；30 min，45% A，55% B；40 min，45% A，55% B；41 min，2% A，98% B；50min，2% A，98% B)，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，检测波长214 nm，进样量10 μL。

1.3.2 供试品溶液的制备 精密量取糖浆剂样品1 mL，置10 mL容量瓶中，加50%甲醇适量，摇匀，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即可。

1.3.3 对照品溶液的制备 精密称取安赛蜜25.39 mg，糖精钠28.88 mg，阿斯巴甜26.27 mg，爱德万甜25.21 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为贮备液(每1 mL含各组分约为1 mg)。精密量取贮备液0.2，0.5，1，1，1，1 mL分别置100，100，100，50，20，10 mL容量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为标准曲线工作溶液，每1 mL含各组分约为2，5，10，20，50，100 μg。

1.3.4 样加标溶液的制备 因无实际样品同时含安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜、爱德万甜4种组分，取一批样品45 mL，加上述贮备液5 mL，涡旋混匀，其余按2.2项同法操作，作为样加标溶液(每1 mL含各组分约为100 μg)，备用。

2 结果与分析

2.1 前处理方法优化

比较乙腈、水、10%甲醇、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、90%甲醇、甲醇作为稀释剂的效果。其中：用乙腈作为稀释剂时，样品不能均匀分散，明显成团；用水、10%甲醇、30%甲醇作为稀释剂，振摇时产生大量气泡，久置不散；用50%以上甲醇溶液作稀释剂，能均匀分散，没有或产生少量气泡，静置即散。由于初始流动相中水相比例高，当样品溶液有机相浓度过高易引起溶剂效应，故选择50%甲醇作为稀释剂。

2.2 色谱条件优化

2.2.1 pH 调节流动相pH值分别为4.5，5.5，6.5，7.5，结果表明pH值5.5时峰形对称，分离效果良好。4种目标物分子中均含有仲氨基团，爱德万甜和阿斯巴甜分子中含有羧基，糖精钠和甜蜜素分子中含磺酸基，均呈现酸碱两性，在强酸或强碱环境下，分子主要呈解离态，峰形拖尾严重，弱酸条件下，分子主要呈游离态，峰形良好，故选择pH值5.5。

2.2.2 磷酸二氢铵浓度 比较了流动相中不同磷酸二氢铵浓度(0.005，0.010，0.020，0.050，0.100 mol/L)下的峰形和分离效果，结果：0.005,0.010 mol/L的分离效果和峰形均较差，0.020,0.050,0.100 mol/L的分离效果和峰形均良好，考虑盐浓度过高对仪器和色谱柱的损伤，故选择0.020 mol/L的磷酸二氢铵。

2.2.3 色谱柱型号 考察4个品牌型号的色谱柱(Waters symmetry-C18、Agilent TC-C18、Inerstil ODS-SP-C18、Shiseido AQ-C18，规格均为4.6 mm×250 mm, 5 μm)对分离效果的影响，分离效果均良好，由于AQ-C18柱耐高水相，建议选用。

2.2.4 流速 比较丁流动相流速对峰形和分离效果。结果表明：流动相流速过低，纵向分子扩散严重，影响峰形和分离效能，提高流速可以有效减少纵向分子扩散，改善峰形提高分离效能；但流速过高，会增加传质阻力，降低分离效能，且会增加柱压损坏色谱柱。其他条件不变，流速在0.8～1.2 mL/min范围内，纵向分子扩散与传质阻力达到较好的平衡状态，4种待测组分分离良好。

2.2.5 柱温 考察了柱温(30,35,40 ℃)对色谱分离效果的影响，结果显示在试验范围内柱温对分离效果、保留时间、峰形、柱压影响不大。提高柱温，虽然可以减少流动相黏滞性，但对于降低传质阻力作用并不明显，而4种待测组分热稳定性好，无需控制低温，因此无需严格控制柱温，建议使用柱温箱保持柱温恒定即可。

2.3 线性范围、检出限与定量限

取标准曲线工作溶液，按1.3.1的色谱条件测定4个组分，以质量浓度(mg/L)为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线。安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜、爱德万甜4种组分在质量浓度为2～100 mg/L范围内线性关系良好，相关系数R2均大于0.999。以信噪比S/N=3计算检出限，S/N=10计算定量限，4种组分线性范围与检测限见表1。由表1可知，检出限和定量限均较低，可见该法灵敏度较好。

表1 4种组分线性范围与检测限Table 1 Linearity range and detection limit of four components (n=6)

2.4 专属性

取经检测不含4种待测成分的小儿止咳糖浆样品溶液、样加标溶液、混合对照品溶液，按1.3.1的色谱条件进样检测，结果如图1所示，4种组分峰形对称，分离良好，保留时间合适，样品中其他成分没有干扰。

2.5 精密度试验

取混合对照品溶液，连续进样6次，结果见表2，4种组分RSD均小于4%(n=6)，说明仪器精密度良好。

表2 精密度试验 Table 2 The test of precision (n=6)

2.6 稳定性试验

取样加标溶液，在0，2，4，8，12，16，20， 24 h进样，平行进2针，以2针的平均峰面积计算，结果见表3，RSD均小于4%(n=8)，说明供试品溶液至少在24 h内稳定，制备后24 h内进样分析不影响结果。

表3 稳定性试验Table 3 The test of stability (n=8)

2.7 重复性试验

取样品(批号：170403)，按1.3.2的方法平行制备供试品溶液6份，按1.3.1的色谱条件测定，结果表明所建立方法重复性良好(见表4)。

表4 重复性试验Table 4 The test of repeatability (n=6)

2.8 回收率试验

精密量取供试品(批号：170403)1 mL，置10 mL容量瓶中，平行量取9份，分为高、中、低3个组，高、中、低组分别精密加入100 μg/mL的混合对照品溶液1.2，1.0，0.8 mL，置振荡器混匀，按1.3.2的方法制备供试品溶液。

1. 安赛蜜 2. 糖精钠 3. 阿斯巴甜 4. 爱德万甜图1 4种目标物的色谱图Figure 1 Chromatogram of 4 kinds of target compounds

精密量取10 μL供试品溶液注入液相色谱仪，依法测定，按式(1)计算回收率。

(1)

式中：

p——回收率，%；

m1——测得加标样品中待测组分的质量，μg；

m2——样品中含待测组分的质量，μg；

m0——加入待测组分标准物质的质量，μg。

由表5可知，安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜、爱德万甜平均回收率分别为98.65%，104.09%，100.96%，102.30%，RSD分别为1.4%，0.8%，1.4%，1.7%(n=9)，说明所建立的方法回收率良好，准确度高。

表5 回收率试验Table 5 The test of recovery (n=9)

2.9 样品测定

按1.3.2的样品制备方法和1.3.1的下色谱条件，测定45批次样品，对样品中出现与对照品保留时间一致的色谱峰，进行纯度测试和光谱指数图一致性比较，能通过纯度测试且与相应对照品光谱指数图一致，判定为检出，其中3批次检出爱德万甜，2批次检出阿斯巴甜和爱德万甜，结果见表6，其他均未检出。

表6 样品测定结果Table 6 The results of sample determination mg/L

3 结论

建立了糖浆剂药品中人工合成甜味剂含量测定方法，该方法可同时测定安赛蜜、糖精钠、阿斯巴甜、爱德万甜4种组分，专属性好、准确可靠、操作简单、线性范围宽，可用于糖浆剂质量安全监测。下一步将继续探索液相色谱—质谱联用定性方法，以液相色谱定量结合液质联用定性建立补充检验方法监测糖浆剂药品中非法添加人工合成甜味剂。