液相色谱串联质谱法测定食用油脂中天然辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素的不确定度评定

黄 辉 廖燕芝

(1. 湖南省市场监督管理局缺陷产品召回服务中心，湖南 长沙 410111；2. 湖南省产商品质量检验研究院，湖南 长沙 410006)

辣椒中含有天然辣椒素、二氢辣椒素、降二氢辣椒素、高二氢辣椒素、高辣椒素、诺香草胺等含辣味的同系物[1]，其中天然辣椒素和二氢辣椒素含量占其总量的90%[2-3]以上，合成辣椒素是人工合成的具有类似天然辣椒素生物学功能的化合物[4]。辣椒素类物质易溶于油脂，且在烹饪过程中具有很好的热稳定性。正常成品食用油脂不含有辣椒素类物质，烹饪辣椒和辣椒调味料后的食用油脂中常含有辣椒素类物质。因此，测定食用油脂中天然辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素含量，可以鉴别食用油脂是否为餐厨废油进行加工提炼的劣质食用油或添加了餐厨废油的劣质食用油[5]。当使用检测结果作为判定依据时，必须了解检测结果的可靠性。其中常用的一个度量参数就是测量不确定度。通过评定测量结果的不确定度[6-8]可确保检测结果的可靠性和鉴定结果的科学合理性。目前有关食用油脂中3种辣椒素含量的测量结果进行不确定度评定[9-12]尚未见报道。研究拟采用液相色谱串联质谱法[13]测定食用油脂天然辣椒素、二氢辣椒素和合成辣椒素含量，依据《化学分析中不确定度的评估指南》(CNAS-GL006: 2019)识别测量不确定度的主要来源，并对每一个来源的不确定度进行评估，以期提高该检测结果的可靠性，为食用油脂质量的鉴定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

天然辣椒素标准品：纯度99.4%，北京曼哈格生物科技有限公司；

合成辣椒素标准品、二氢辣椒素：纯度98.5%，北京曼哈格生物科技有限公司；

乙腈、甲醇：色谱纯，德国默克化工公司；

甲酸：色谱纯，阿拉丁试剂(上海)有限公司；

二氯甲烷、氢氧化钠、硫酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

食用油：市售。

1.2 仪器与设备

液相色谱—质谱连用仪：Agilent 6460型，美国安捷伦科技有限公司；

电子天平：XS205DU型，梅特勒—托利多国际贸易(上海)有限公司；

超纯水仪：Milli-Q型，美国密理博公司；

氮吹仪：N-ECAP45型，美国Organomation 公司；

固相萃取装置：HSE-24B型，天津市恒奥科技发展有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品处理 准确称取1 g(精确至0.000 1 g)食用油于10 mL具塞离心试管中，分别加入1 mL二氯甲烷和3 mL 2%氢氧化钠溶液，涡旋提取10 min，10 000 r/min离心5 min，取上层水相；残留有机相用3 mL 2%氢氧化钠溶液重复提取一次，合并水相，再用稀硫酸(V硫酸∶V水=1∶15)溶液调节pH至2.5后进行下一步固相萃取。分别采用3 mL乙腈淋洗C18固相萃取小柱(规格1 000 mg/6 mL)3次进行活化，3 mL纯水淋洗2次平衡固相萃取柱，将提取液加入SPE小柱，3 mL超纯水淋洗2次，3 mL乙腈洗脱2次，接收洗脱液。洗脱液50 ℃水浴氮吹近干，用1 mL A级移液管准确移取0.50 mL甲醇溶解后过0.22 μm微孔滤膜，滤液为LC-MS/MS待测液[12]。

1.3.2 仪器条件

(1) 色谱条件：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(2.1 mm×100 mm, 3.5 μm)；流动相及梯度洗脱条件见表1；流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量10.0 μL。

表1 流动相及梯度洗脱条件Table 1 Mobile phase and gradient system conditions

(2) 质谱条件：电喷雾离子源(ESI源)；正离子扫描；多反应监测MRM；离子喷雾电压4 000 V；干燥气温度350 ℃；干燥气流量9 L/min；雾化气压力276 kPa；化合物定量和定性离子见表2。

表2 化合物定性、定量离子和质谱分析参数Table 2 Compound qualitative, quantitative ion and mass spectrometry parameters

1.3.3 标准曲线的制作 分别精确称取合成辣椒素标准品0.025 16 g，天然辣椒素标准品0.025 40 g，二氢辣椒素标准品0.025 39 g，于3个25 mL A级容量瓶，加入适量甲醇溶解，定容后摇匀，得到质量浓度为1.000 mg/mL标准储备液。分别用1 mL A级移液管准确移取1.00 mL 3种标准储备液于100 mL容量瓶(A级)中，用甲醇稀释至质量浓度为10.00 μg/mL混合标准中间液[14]。用1 mL A级移液管准确移取10.00 μg/mL混合标准工作液0.10 mL于100 mL容量瓶，用甲醇稀释成质量浓度为1 000 ng/mL混合标准使用液。用1 mL A级移液管分别准确移取10.00 ng/mL混合标准使用液，配制成0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 ng/mL系列混合标准工作液，过0.22 μm尼龙膜，供液LC-MS/MS测定。

2 试验与结果

2.1 数学模型

按式(1)计算辣椒油中合成辣椒素、天然辣椒素和二氢辣椒素含量。

(1)

式中：

X——试样中合成辣椒素、天然辣椒素和二氢辣椒素含量，μg/kg；

v——试样定容体积，mL；

c——测定试液中合成辣椒素、天然辣椒素和二氢辣椒素的质量浓度，ng/mL；

c0——空白试液中合成辣椒素、天然辣椒素和二氢辣椒素的质量浓度，ng/mL；

1 000——单位换算系数；

f——稀释倍数。

2.2 测量不确定度来源分析

由检测过程和数学模型可知，食用油脂中辣椒素类物质含量测定的不确定度来源主要包括标准物质的纯度和称量、混合标准工作液的配制和稀释、标准曲线的拟合、样品的称量和定容、仪器的测定，以及检测回收率和测量重复性[15]。

2.3 测量不确定度分量的评定

表3 标准物质纯度引入的相对不确定度Table 3 Uncertainty introduced by each measuring tool

表4 标准物质称量引入的相对不确定度Table 4 Uncertainty introduced by each measuring tool

2.3.3 混合标准工作液配制和稀释引入的不确定度

(1) 标准储备液定容引入的不确定度：配制标准储备液需要使用25 mL A级容量瓶3个，该过程引入的不确定度来源于容量瓶的校准和温度，根据《常用玻璃量器》

1.3 统计学处理 采用SPSS22.0统计软件进行分析。以描述性与推论性统计的百分比、平均值、标准偏差、t检验、皮尔森积差相关分析与单因子变异数分析来呈现医护人员在相关因素的分布情形、个人基本资料与其认知及3个相关因素结构面间的相关性。

(2) 配制混合标准工作液引入的不确定度：配制混合标准中间液、混合标准工作液过程中，使用1 mL A级移液管6根，5 mL A级移液管2根、10 mL容量瓶6个、100 mL容量瓶2个，量具引入的相对不确定度计算方法同2.3.3(1)，结果见表5。

表5 各量具引入的不确定度Table 5 Uncertainty introduced by each measuring tool

2.3.4 标准曲线拟合引入的不确定度 混合标准工作液系列质量浓度分别为0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00，10.00 ng/mL，对混合标准工作液的每个浓度点重复测定3次，用最小二乘法对混合标准工作液的浓度与峰面积进行拟合，得到线性回归方程，通过式(2)计算残差标准差s，再按式(3)计算拟合标准曲线得出标准不确定度，结果见表6。

(2)

表6 线性回归方程Table 6 Linear regression equation

(3)

式中：

Aj——第i个标准溶液的第j次计数值；

B1——线性方程的斜率；

B0——线性方程截距；

Ci——第i个标准溶液的质量浓度，μg/mL；

C0——样品的平均质量浓度，μg/mL；

urel(s)——标准曲线引入的标准不确定度；

S——工作液峰面积残差的标准差；

P——样品溶液的测量次数，7；

n——标准溶液的测量次数，21。

2.3.6 样品待测液定容引入的不确定度 样品提取净化液氮吹近干，用1 mL A级移液管准确移取0.50 mL甲醇溶解，得到样品待测液。20 ℃时甲醇的膨胀系数为1.18×10-3℃-1，计算过程同2.3.3(3)，则样品待测液定容引入的不确定度为urel(v6)=0.005 7。

2.3.8 重复测定样品引入的不确定度 取加标样品重复检测7次(n=7)，则重复测定样品引入的标准偏差和相对标准不确定度见表7。

表7 重复测定引入的不确定度Table 7 Uncertainty introduced by repeated determination

2.3.9 样品回收率引入的相对不确定度 对空白试样进行加标试验(n=7)，天然辣椒素添加量为0.225 μg/kg，合成辣椒素添加量为0.45 μg/kg，二氢辣椒素添加量为0.225 μg/kg，则样品回收率引入的标准偏差和相对标准不确定度见表8。

表8 样品回收率引入的不确定度Table 8 Uncertainty introduced by sample recovery

使用加标回收率校正因子后，测定食用油中合成辣椒素含量X=0.215/0.86=0.250，天然辣椒素含量X=0.116/0.946=0.123，二氢辣椒素含量X=0.115/0.883=0.130。

2.3.10 合成相对标准不确定度 合成上述各不确定度分量得到相对合成不确定度，该测量误差的分布类型属正态分布，在置信水平为95%时，取k=2，故扩展不确定度U=urel×k×X计算得出扩展不确定度见表9。

表9 不确定度评定Table 9 Uncertainty introduced by sample recovery

液相色谱串联质谱法测定油脂中辣椒素类含量测定结果表示为：合成辣椒素含量(0.250±0.032) μg/kg，天然辣椒素含量(0.123±0.015) μg/kg，二氢辣椒素含量(0.130±0.014) μg/kg，k=2。

3 结论

通过建立数学模型，对液相色谱—质谱联用法测定食用油脂中合成辣椒素、天然辣椒素和二氢辣椒素可能引入的不确定度分量进行了评定。从评定结果可知，测定过程中不确定度的主要来源于标准曲线拟合和仪器测定，因此，在实际检测中可以通过优化标准曲线的配制，定期对测定仪器进行维护保养，减小测量结果的不确定度，从而提高检测结果的准确度，该评定方法可为液相色谱质谱联用法测定食用油脂中合成辣椒素、天然辣椒素和二氢辣椒素含量的测量及结果判定提供参考。今后需要进一步提高检验人员试验操作水平、定期对测定仪器进行维护，期间核查和检定以提高仪器的稳定性和精密度，从而减小测定结果的不确定度。