艾草黄酮提取工艺优化及抗氧化活性研究

王 娜 张昊宇 宁灿灿 范允涛 王林青 余秋颖

(1. 河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002；2. 郑州市营养与健康食品重点实验室，河南 郑州 450002；3. 农业农村部大宗粮食加工重点实验室，河南 郑州 450002；4. 北京丰森源林业科技有限公司，北京 102100；5. 郑州师范学院分子生物学重点实验室，河南 郑州 450044)

艾草(Artemisiaargyi)，又称艾蒿、香艾、冰台等，为菊科多年生草本植物[1]，在中国已有2 000余年药食两用历史。艾草主要化学成分包括挥发油类、黄酮类、三萜类、多糖以及微量元素[2-4]等。黄酮类物质是艾草主要成分，天然植物中黄酮类物质抗炎特性目前已有报道，黄酮类物质作为有效的抗氧化剂，能够清除机体内的各类自由基并抑制其形成[5-7]。

常见的艾草总黄酮传统提取工艺包括加压溶剂法、浸提法、索氏抽提法等，但是艾草总黄酮得率相对较低(提取率≤6%)，且提取时间较长[8-10]。近年来利用微波、超声波及超声—微波协同提取艾草活性物质的研究已有报道[11-13]，但多数研究仅关注艾草总黄酮得率，并未同时考察艾草黄酮抗氧化活性。研究拟以艾草总黄酮得率和抗氧化活性为考察指标，优化艾草黄酮的提取工艺条件以期为艾草黄酮进一步的应用研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

艾草：品种宛艾(一年贮存期内)，产地北京延庆，水分含量25%；

芦丁标准品：纯度≥95.0%，北京索莱宝科技有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)标准品：纯度≥97.0%，福州飞净生物科技有限公司；

无水乙醇：分析纯，天津富宇精细化工有限公司；

亚硝酸钠、硝酸铝、硫酸亚铁、水杨酸：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；

30%过氧化氢溶液：分析纯，烟台市双双化工有限公司。

1.2 仪器与设备

双光束紫外可见分光光度计：TU-1901型，北京普析通用仪器有限责任公司；

微孔板分光光度计：BioTek/epoc型，美国BioTek instruments公司；

微波光波超声波萃取仪：Sientz-IIDM型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

高速多功能粉碎机：HC-200T型，武义海纳电器有限公司；

台式低速离心机：TD-5A型，湖南赫西离心机仪器有限公司；

电子分析天平：FA1204型，宁波力辰科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 芦丁标准曲线绘制 取芦丁标准品10 mg，置于50 mL容量瓶中，使用60%乙醇定容得到0.2 mg/mL的芦丁标准品溶液，分别取0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL芦丁标准品溶液于10 mL具塞试管中，按照亚硝酸钠—硝酸铝—氢氧化钠法显色后使用60%乙醇定容至10 mL，参照文献[14]进行线性关系考察，以芦丁浓度(c)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程：A=12.666c+0.009 5，R2=0.999 2，在芦丁标准品浓度0.00～0.05 mg/mL范围内线性关系良好。

1.3.2 艾草黄酮提取方法选择

(1) 超声—微波辅助水提：参考王琴等[15]的方法，稍作修改。干艾草10.0 g，粉碎30 s，按m干艾草∶V水=1∶30 (g/mL)加去离子水，混匀，60 ℃水浴处理40 min后将料液置于微波光波超声波萃取仪中，设置超声功率460 W、超声时间30 min、微波功率600 W、微波时间120 s，提取后将料液过滤，5 000 r/min离心10 min取上清液，得到艾草黄酮提取液。

(2) 超声—微波辅助醇提：干艾草10.0 g，粉碎30 s，按m干艾草∶V乙醇=1∶30 (g/mL)加入体积分数60%的乙醇溶液，混匀，将样品置于微波光波超声波萃取仪中，设置超声功率460 W、超声时间30 min、微波功率600 W、微波时间120 s，提取后将料液过滤，5 000 r/min离心10 min 取上清液，得到艾草黄酮提取液[13]。

(3) 传统煎煮：参考朱瑜等[16]的方法，稍作修改。干艾草10.0 g，粉碎30 s，按m干艾草∶V水=1∶30 (g/mL)加去离子水，混匀，将料液煮沸10 min后过滤，滤渣加入相同比例的水进行二次煎煮，合并滤液，5 000 r/min离心10 min，得到艾草黄酮提取液。

(4) 水浴加热提取：参考郑云展等[17]的方法，稍作修改。干艾草10.0 g，粉碎30 s，按m干艾草∶V水=1∶30 (g/mL)加去离子水，混匀，95 ℃水浴处理120 min后将料液过滤，5 000 r/min离心10 min，得到艾草黄酮提取液。

1.3.3 单因素试验设计 由于试验所用微波光波超声波萃取仪处于恒温模式的仪器无法恒定微波功率和工作时间，同时恒温模式控温不精准。故提取过程中不对温度进行控制，艾草总黄酮提取液在提取结束后的温度约为70～75 ℃。

(1) 超声时间：取样品10.0 g，固定超声功率340 W，微波时间120 s，微波功率600 W，料液比1∶30 (g/mL)，考察超声时间(20，25，30，35，40 min)对艾草总黄酮得率及抗氧化活性的影响。

(2) 超声功率：取样品10.0 g，固定超声时间30 min，微波时间120 s，微波功率600 W，料液比1∶30 (g/mL)，考察超声功率(220，280，340，400，460 W)对艾草总黄酮得率及抗氧化活性的影响。

(3) 微波时间：取样品10.0 g，固定超声时间30 min，超声功率340 W，微波功率600 W，料液比1∶30 (g/mL)，考察微波时间(60，90，120，150，180 s)对艾草总黄酮得率及抗氧化活性的影响。

(4) 微波功率：取样品10.0 g，固定超声时间30 min，超声功率340 W，微波时间120 s，料液比1∶30 (g/mL)，考察微波功率(300，400，500，600，700 W)对艾草总黄酮得率及抗氧化活性的影响。

(5) 料液比：取样品10.0 g，固定超声时间30 min，超声功率340 W，微波时间120 s，微波功率600 W，考察料液比[1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL)]对艾草总黄酮得率及抗氧化活性的影响。

1.3.4 Plackett-Burman试验设计 以单因素试验设计为基础，将超声时间、超声功率、微波时间、微波功率和料液比5个试验因素分别设置高、低2个水平，以艾草总黄酮得率为响应值，共设计12组试验，筛选出对艾草总黄酮得率影响较高的因素进行响应面试验。

1.3.5 响应面试验设计 以超声功率、超声时间和料液比3个对响应值影响显著的因素为自身变量，以艾草总黄酮提取率为响应值，利用Design-Expert 12.0软件进行响应面试验设计。

1.3.6 艾草总黄酮得率测定 采用紫外分光光度法[14]测定总黄酮含量，按式(1)计算艾草总黄酮得率。

(1)

式中：

Y——艾草总黄酮得率，mg/g；

c——供试品溶液的艾草总黄酮浓度，mg/mL；

n——稀释倍率；

V——艾草提取液体积，mL；

m——艾草质量，g。

1.3.7 抗氧化活性指标的测定

(1) 艾草总黄酮清除DPPH自由基能力：参考文献[18]，按式(2)计算DPPH自由基清除率。

(2)

式中：

Q——DPPH自由基清除率，%；

Ai——2 mL样品溶液+ 2 mL 0.1 mol/L DPPH溶液的吸光度；

Aj——2 mL样品溶液+ 2 mL无水乙醇的吸光度；

Ac——2 mL无水乙醇+ 2 mL 0.1 mol/L DPPH溶液的吸光度。

(2) 艾草总黄酮清除羟自由基能力：参考文献[19]，按式(2)计算羟自由基清除率。

(3)

式中：

Q——羟自由基清除率，%；

A1——2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液+2 mL 9 mmol/L水杨酸—乙醇+2 mL 9 mmol/L H2O2+2 mL样品溶液的吸光度；

A2——2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液+2 mL 9 mmol/L水杨酸—乙醇+2 mL样品溶液的吸光度；

A0——2 mL 9 mmol/L FeSO4溶液+2 mL 9 mmol/L水杨酸—乙醇+2 mL 9 mmol/L H2O2吸光度。

1.4 统计分析

采用SPSS 22.0进行方差分析；Design-Expert 12.0进行响应面试验设计和结果分析。

2 结果与分析

2.1 艾草总黄酮提取方法选择

预试验发现，超声提取法艾草总黄酮得率47.90 mg/g，DPPH自由基清除率79.81%，羟自由基清除率61.65%；微波提取法艾草总黄酮得率为42.53 mg/g，DPPH自由基清除率78.52%，羟自由基清除率53.64%，两种提取方法的得率明显偏低，抗氧化活性方面优势不明显，故筛选艾草总黄酮提取方法时未将上述两种提取方法纳入比较。

由表1可知，各提取方法间艾草总黄酮得率有显著性差异(P<0.05)，传统煎煮法的艾草总黄酮得率最高，超声—微波辅助水提法次之；水浴加热提取法的DPPH自由基清除率最高，但与超声—微波辅助水提法差异不显著；超声—微波辅助水提法的OH自由基清除率最高，且与其他方法差异显著(P<0.05)。由于传统煎煮法与水浴加热提取法耗时较长，同时综合考虑黄酮得率及抗氧化活性，确定超声—微波辅助水提法作为艾草总黄酮的理想提取方法，并优化其提取工艺。

表1 提取方法对总黄酮得率与抗氧化活性的影响†Table 1 Effects of different extraction methods on flavonoid yield and antioxidant activity

2.2 单因素试验

2.2.1 超声处理时间对总黄酮得率和抗氧化活性的影响

由表2可知，超声时间30，40 min时艾草总黄酮得率和羟自由基清除率同其他组差异显著(P<0.05)，超声30 min 时DPPH自由基清除率最高且与其他组差异显著(P<0.05)。综合考虑，超声时间选择30 min。

表2 超声时间对总黄酮得率和抗氧化活性的影响†Table 2 The effects of ultrasonic time on flavonoid yieldand antioxidant activity

2.2.2 超声功率对总黄酮得率和抗氧化活性的影响 由表3可知，超声功率340 W时艾草总黄酮得率最高，与其他组差异显著(P<0.05)；超声功率340，460 W的DPPH

表3 超声功率对总黄酮得率和抗氧化活性的影响†Table 3 The effects of ultrasonic power on the yield and antioxidant activity

自由基清除率较高且二者差异不显著。综合考虑，超声功率选择340 W。

2.2.3 微波处理时间对总黄酮得率和抗氧化活性的影响

由表4可知，微波时间180 s时艾草总黄酮得率最高，微波时间120 s时次之。由于微波时间120 s时DPPH自由基与羟自由基清除率均最高，因此选择微波时间120 s。

表4 微波处理时间对总黄酮得率和抗氧化活性的影响†Table 4 The effects of microwave treatment time on the yield and antioxidant activity

2.2.4 微波功率对总黄酮得率和抗氧化活性的影响 由表5可知，微波功率600 W时艾草总黄酮得率与DPPH自由基清除率最高，与其他组间差异显著(P<0.05)。微波功率500，600 W的羟自由基清除率较高，且二者差异不显著。综合考虑，选择微波功率600 W。

表5 微波功率对总黄酮得率和抗氧化活性的影响†Table 5 The effects of microwave power on the flavonoid yield and antioxidant activity

2.2.5 料液比对总黄酮得率和抗氧化活性的影响 由表6 可知，料液比1∶20 (g/mL)时艾草总黄酮得率最高，与其他各组间差异显著(P<0.05)，料液比1∶30 (g/mL) 时次之。料液比1∶30 (g/mL)时DPPH自由基清除率和羟自由基清除率最高。综合考虑，选择料液比1∶30 (g/mL)。

表6 料液比对总黄酮得率和抗氧化活性的影响†Table 6 The effects of solid-liquid ratio on flavonoid yield and antioxidant activity

2.3 Plackett-Burman试验

Plackett-Burman试验设计及结果见表7、表8，试验结果方差分析见表9。

表7 Plackett-Burman试验设计Table 7 Experimental design of Plackett-Burman design

表8 Plackett-Burman试验结果Table 8 Results of Plackett-Burman design

由表9可知，超声时间、超声功率和料液比3个因素对艾草总黄酮得率影响极显著(P<0.01)，选择以上3个因素进行响应面优化设计试验。微波时间和微波功率两个因素对艾草总黄酮提取影响较低，后续试验中将其固定为120 s和600 W。

表9 Plackett-Burman 试验结果方差分析表†Table 9 Analysis of variance of Plackett-Burman design

2.4 响应面优化试验

2.4.1 试验设计及结果 响应面试验优化水平设计见表10。

表10 响应面试验设计因素及水平表Table 10 Factors and levels of response surface design

利用Design-Expert 12.0对表11的数据进行方差分析和回归分析，对试验结果进行拟合。以超声功率、超声时间和料液比为自变量，拟合得到回归方程：

表11 响应面试验设计及结果Table 11 Experimental design and results of response surface design

Y=-549.88+3.08A+3.66B+4.12C-0.000 6AB+0.002 7AC+0.024BC-0.004 6A2-0.077B2-0.091C2。

(4)

表12 响应面试验结果方差分析表†Table 12 Analysis of variance of response surface design

2.4.3 最佳工艺的修订及验证实验 通过Design-Expert 12.0得到最佳提取工艺为：超声功率339.83 W、超声27.08 min、料液比1∶31.14 (g/mL)，艾草总黄酮得率达到最大值87.70 mg/g。考虑实际操作，工艺参数调整为：

料液比1∶30 (g/mL)、60 ℃水浴40 min、超声功率340 W、超声时间27 min、微波功率600 W、微波处理120 s，进行3组平行验证实验，其艾草总黄酮得率均值为87.93 mg/g，与预测值(87.70 mg/g)相差0.03%，相对标准偏差为0.61%，接近模型预测值，说明预测模型可靠。

2.5 最佳工艺与传统煎煮、水浴热提取的比较

由表13可知，试验所得最佳提取工艺在艾草总黄酮得率和羟自由基清除率方面显著优于传统煎煮法、水浴加热提取法。

表13 最佳工艺与传统方法的艾草总黄酮得率与抗氧化活性比较†Table 13 Comparison of flavonoid yield and antioxidant activity between optimal process and traditional process

3 结论

以艾草总黄酮得率、DPPH自由基清除率、羟自由基清除率为指标，采用Plackett-Burman试验及响应面试验优化超声—微波辅助水提工艺，结果表明，艾草黄酮的最佳提取工艺为60 ℃水浴40 min，超声340 W处理27 min，微波600 W处理120 s，料液比1∶30 (g/mL)，此时艾草总黄酮得率可达87.93 mg/g，DPPH自由基清除率为80.84%，羟自由基清除率为77.92%，其艾草总黄酮得率和羟自由基清除率显著优于传统煎煮和水浴加热法。试验未进一步探究艾草黄酮物质组成及各组分生物活性，后续将以大孔树脂纯化艾草总黄酮后使用高效液相—质谱联用法对艾草总黄酮纯度以及组成成分等进行分析研究。