微波辅助萃取蓝莓花色苷工艺优化及热动力学分析

翟赛亚 姚会敏

(河南质量工程职业学院食品与化工学院，河南 平顶山 467000)

蓝莓(Vacciniumspp.)富含花色苷[1]。大量研究表明花色苷可显著清除过量自由基，具有较好抗氧化活性[2]，同时可抑制相关炎症发生[3]和肿瘤细胞的生长[4]。目前，主要利用回流提取法提取植物基的花色苷，但该方法萃取效率低，溶剂消耗较大，耗时长。为提高花色苷萃取率，并克服传统萃取的缺点，一些具有发展潜力的萃取技术被用于花色苷的提取中，如微波辅助提取(Microwave-assisted extraction，MAE)、超声波辅助萃取、超临界萃取和超高压辅助萃取等技术，其中MAE具有萃取得率高、节能环保、溶剂消耗少和过程易控制等优点[5]，该技术被成功应用到黄酮类[6]、油脂类[7]、多酚类[8]等活性成分的提取中。

研究将在单因素试验基础上，通过响应面耦合遗传算法优化MAE蓝莓花色苷的工艺参数。在此基础上，利用Fick第一定律建立花色苷的传质动力学模型，依据Arrhenius方程和相变平衡原理，获得萃取过程中的活化能(Ea)、熵变(ΔS)、焓变(ΔH)和吉布斯自由能变(ΔG)，分析MAE过程的热力学，以期为蓝莓花色苷进一步深加工提供重要的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

美登蓝莓：2020年采摘于东北小兴安岭地区，冷藏备用；

矢车菊-3-O-葡萄糖苷(C3G)：纯度≥98.5%，宝鸡市国康生物科技有限公司；

浓盐酸、甲醇、无水乙醇：分析纯，济南涵百化工有限公司。

1.2 仪器与设备

分析天平：BSA224S-CW型，上海双旭电子有限公司；

高级微波萃取系统：Milestone Ethos-8型，意大利milestone公司；

离心机：GL21M型，湖南凯达科学仪器有限公司；

精密数显恒温水浴锅：J-HH-4A型，冠森生物科技(上海)有限公司；

紫外—可见分光光度计：尤尼柯UV-3802S型，上海四蓝仪器设备公司；

冻干机：LGJ-10FD型，北京松源华兴科技发展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蓝莓前处理 首先将新鲜蓝莓进行挑选、除杂和清洗后，打浆，置于-20 ℃下预冻12 h后，冷冻干燥(至干基含水率低于5%)并粉碎，过40目筛，封装，于4 ℃下避光保存备用。

1.3.2 萃取 以2.00 g蓝莓果粉为原料，按m蓝莓果粉∶V乙醇为1∶30 (g/mL)添加体积分数为60%的乙醇并混匀，置于微波工作站进行提取，待萃取结束后进行离心(5 000 r/min，15 min)，取上清液，所得残渣重复上述操作3次，合并提取液，用于花色苷得率测定。

1.3.3 花色苷萃取率的测定 参考Shen等[9]的方法。

(1)

(2)

式中：

C——花色苷质量浓度，mg/mL；

ΔApH 1.0——pH 1.0时提取液在510 nm和700 nm处的吸光度差值；

ΔApH 4.5——pH 4.5时提取液在510 nm和700 nm处的吸光度差值；

f——稀释倍数；

y——花色苷提取率，%；

Mω——矢车菊-3-O-葡萄糖苷的相对分子质量，g/mol；

ε——矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔吸光系数，L/(cm·mol)；

L——光程，cm；

V——提取液体积，mL；

m——蓝莓粉末质量，g。

1.3.4 单因素试验

(1) 萃取温度对蓝莓花色苷提取率的影响：固定萃取时间为6 min、乙醇体积分数为60%、料液比为1∶30 (g/mL)，萃取温度分别设置为30，40，50，60，70 ℃。

(2) 萃取时间对蓝莓花色苷提取率的影响：固定萃取温度为50 ℃、乙醇体积分数为60%、料液比为1∶30 (g/mL)，萃取时间分别设置为2，4，6，8，10 min。

(3) 乙醇体积分数对蓝莓花色苷提取率的影响：固定萃取温度为50 ℃、萃取时间为6 min、料液比为1∶30 (g/mL)，乙醇体积分数分别设置为40%，50%，60%，70%，80%。

(4) 料液比对蓝莓花色苷提取率的影响：固定萃取温度为50 ℃、萃取时间为6 min、乙醇体积分数为60%，料液比(m蓝莓果粉∶V乙醇)分别设置为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50 (g/mL)。

1.3.5 响应面试验 在单因素试验基础上，选择的自变量分别为萃取温度、萃取时间、乙醇体积分数和料液比，响应值为花色苷萃取率(Y)。基于RSM中的Box-Behnken进行设计。

1.3.6 遗传算法设计 选取萃取温度(X1)、萃取时间(X2)、乙醇体积分数(X3)和料液比(X4)4个因素为决策变量，即：

X=X(X1，X2，X3，X4)。

(3)

(4)

(5)

遗传算法优化花色苷提取工艺的约束条件如式(6)所示。

(6)

1.4 花色苷萃取动力学

在MAE蓝莓花色苷的过程中，花色苷在蓝莓颗粒内溶解，然后由蓝莓颗粒内扩散到颗粒表面，进而扩散到主体溶液中的过程[10]。在MAE过程中花色苷浓度变化如图1所示。

图1 萃取过程中花色苷浓度变化Figure 1 Changes of anthocyanins concentration in the extraction process

根据Fick第一定律，在任意t时刻通过固液界面的传质通量J为：

(7)

(8)

式(8)表明花色苷的扩散速率与传质表面积和质量浓度梯度呈正比。

某时刻质量浓度梯度随时间的递减速率与该时刻浓度梯度呈正比[11]。

(9)

式中：

k——花色苷的提取速率常数。

对式(9)进行积分可得：

(10)

将式(8)和式(10)联立可得：

(11)

(12)

依据R2和标准估计误差(Standard Error of Estimate，SEE)作为评价提取动力模型，其表达式分别如式(13)和式(14)所示。

(13)

(14)

式中：

ESE——标准估计误差；

YAC——花色苷含量的试验值，mg/mL；

1.5 花色苷的提取热力学

花色苷微波萃取过程中符合相变平衡，其表达式如式(15)所示。

(15)

根据式(15)计算出组分的分配系数K，随后将K数据代入van’t Hoff方程中，可以计算出MAE过程中ΔH和ΔS。

(16)

利用式(17)可计算MAE过程中的ΔG。

ΔG=ΔH-TΔS。

(17)

1.6 数据处理

利用SPSS 12.0对单因素试验结果进行方差分析；利用Matlab R2018b软件优化提取工艺以及对动力学模型进行求解；利用Design Expert 8.0软件设计MAE蓝莓花色苷的组合试验；利用Origin 9.0Pro对单因素试验进行作图分析。

2 结果与分析

2.1 微波萃取条件对蓝莓中花色苷萃取率的影响

由图2(a)可知，当萃取温度在50 ℃以下时，花色苷萃取率随萃取温度的增加而显著增加，在50 ℃时，花色苷萃取率达到最大值(80.52±1.75)%。其原因是萃取温度增加有助于更多的花色苷被溶出，同时扩散系数增加，使得花色苷在萃取液中溶解度最大[12]。当萃取温度继续上升时，花色苷萃取率却显著降低(P<0.05)，可能与花色苷属于热敏性成分，高温破坏了其结构有关[13]。综合考虑萃取温度选择40，50，60 ℃ 3个水平进行组合试验(见表1)。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图2 单因素对花色苷萃取率的影响Figure 2 Effects of single factor on extraction rate of anthocyanins

由图2(b)可知，当萃取时间小于6 min时，花色苷萃取率随萃取时间延长而增加，在6 min时，花色苷萃取率达到最大值(80.11±1.64)%。但当萃取时间超过6 min时，萃取时间越长，越不利于花色苷的提取。这可能是由于花色苷不稳定，易被空气中的氧气氧化造成其结构的破坏，导致花色苷萃取率降低[14]。综上萃取时间选择4，6，8 min 3个水平进行组合试验(见表1)。

表1 单因素试验结果Table 1 Single factor experimental results

由图2(c)可知，当乙醇体积分数为40%～60%时，随乙醇体积分数增加花色苷萃取率显著增加(P<0.05)；当乙醇体积分数超过60%时，花色苷萃取率随乙醇体积分数增加而显著降低(P<0.05)。其原因可能是随乙醇体积分数增加花色苷在萃取液中溶解度和扩散系数增加，有助于花色苷的提取[15]。但高浓度的乙醇会加快杂质的溶解，导致花色苷的溶解度降低，从而使得花色苷萃取率降低[16]。因此，乙醇体积分数选择40%，50%，60% 3个水平进行组合试验(见表1)。

由图2(d)可知，当料液比在1∶30～1∶40 (g/mL)范围内，花色苷萃取率随料液比增加呈先显著增加后显著降低(P<0.05)。在1∶30 (g/mL)时，花色苷萃取率取得最大值。因此选择料液比在1∶20，1∶30，1∶40 (g/mL) 3个水平进行组合试验(见表1)。

2.2 响应面试验

2.2.1 RSM模型构建和显著性检验 试验方案和结果见表2。以花色苷萃取率Y为响应值，剔除不显著的因素，对试验结果进行多元回归拟合，所得方程如式(18)所示。

表2 响应曲面试验设计及结果Table 2 Experimental design and results of RSM

(18)

表3 回归模型系数的方差分析†Table 3 Variance analysis of regression model coefficients

2.2.2 两因素的交互作用对花色苷萃取率的影响 综合图3各因素对花色苷萃取率的交互作用影响得知，当萃取温度在45～55 ℃、萃取时间5～7 min、乙醇体积分数45%～55%、料液比在1∶25～1∶35 (g/mL)条件下，蓝莓花色苷萃取率较高。

图3 试验因素的交互作用对花色苷萃取率的影响Figure 3 Effects of interaction of test factors on the yield of anthocyanins

2.2.3 MAE蓝莓花色苷的工艺参数优化 利用Matlab R2018b软件中的遗传算法工具箱优化花色苷的提取工艺，其结果如图4所示。由图4可知，当迭代93次，花色苷萃取率达到最大值，此时萃取温度、萃取时间、乙醇体积分数和料液比水平编码分别为1，1，0.702，0.16，即试验水平分别为60 ℃、8 min、57.02%和1∶31.6 (g/mL)，花色苷萃取率的理论值为84.40%。

图4 遗传算法的优化结果Figure 4 The results optimized by the genetic algorithm

2.2.4 验证实验 为验证遗传算法的可靠性，结合实际情况，将工艺参数修正为：萃取温度60 ℃、萃取时间8 min、乙醇体积分数57%和料液比1∶32 (g/mL)，在上述参数下进行3次重复实验，所得花色苷萃取率试验值(83.15±2.03)%，试验值和理论值的相对误差为1.48%。

说明采用遗传算法优化MAE蓝莓花色苷工艺参数是可行的。

2.3 动力学模型的求解

依据不同萃取温度下花色苷萃取动力学结果，将ln[C∞/(C∞-C)]对萃取时间t进行作图，其结果如图5所示。由图5可知，随萃取时间延长，ln[C∞/(C∞-C)]的值显著增加，且在相同萃取时间内，萃取温度越高，ln[C∞/(C∞-C)]的值越大。

对图5的试验数据进行回归，分别得到提取速率常数(k)、常数(c)，通过R2和SEE大小来判断模型的精度，不同萃取温度下，回归结果如表4所示。由表4可知，随着萃取温度的增加，c和提取速率常数k均增加。ln[C∞/(C∞-C)]与t之间的R2>0.99，SEE<4.20。结果表明所建立的花色苷萃取动力学模型能够准确预测不同提取温度下花色苷萃取效果。

图5 不同萃取温度与萃取时间的动力学拟合结果Figure 5 Kinetic fitting results of different extraction temperature and extraction time

在MAE过程中，提取速率常数k与萃取温度符合Arrhenius方程，如式(19)所示[17]。

(19)

将式(19)两边同时取对数，可得式(20)。

(20)

将表4中的k值，代入式(20)中，然后通过lnk对1/T进行线性拟合作图，如图6所示，由于直线的斜率为Ea/R，

表4 不同萃取温度下ln[C∞/(C∞-C)]与萃取时间t的回归结果Table 4 Regression equations between ln[C∞/(C∞-C)] and t at different temperatures

截距为lnA0，因此通过拟合方程计算出Ea和A0值。

由图6可知，所得的拟合方程为lnk=-4 872.24/T+7.46，R2=0.872 5。通过拟合方程可以计算出MAE过程中的活化能Ea为40.51 kJ/mol，A0为1 737.15。微波萃取的活化能比溶剂萃取[18]的低。结果表明微波能降低萃取体系内的Ea，从而强化植物细胞内活性成分的提取。

图6 不同温度与提取速率常数拟合关系Figure 6 Fitting relationship between different temperature and extraction rate constant

2.4 花色苷提取的热力学分析

根据式(16)作lnK与1/T图，直线斜率为-ΔH/R，截距为ΔS/R(图7)。由图7可知，线性拟合的回归方程为lnK=22.93-5.06/T，R2=0.993 0，拟合曲线的斜率为-ΔH/R，截距为ΔS/R，通过回归方程计算得出ΔH为42.07 J/mol和ΔS为190.64 J/mol。在MAE过程中ΔH和ΔS均大于零，说明MAE属于吸热熵增加的过程。

图7 不同温度与分配系数的拟合关系Figure 7 Fitting relationship between different temperatures and distribution coefficient

由表5可知，随萃取温度增加，ΔG逐渐减小，且均小于零，说明微波在不同温度下提取过程是一个自发过程。

表5 花色苷提取过程中自由能变Table 5 Free energy changes for anthocyanins extractionat different temperatures

3 结论

通过响应面耦合遗传算法优化微波辅助萃取蓝莓花色苷的工艺，得到最优工艺参数为萃取温度60 ℃、萃取时间8 min、乙醇体积分数57%和料液比1∶32 (g/mL)，花色苷萃取率(83.15±2.03)%；通过微波辅助萃取蓝莓花色苷的动力学模型发现提取速率常数随萃取温度的增加而增大；在微波辅助萃取过程中，Ea、ΔS和ΔH分别为40 510.00，42.07，190.64 J/mol，ΔG小于零，说明微波辅助萃取过程属于吸热、熵增加、自发的过程。