植物乳杆菌生物转化南瓜多糖工艺优化

时间：2024-07-28

李小杰郭怡马倩王璞肖萍,2

(1. 天津农学院食品科学与生物工程学院，天津 300392；2. 天津市农副产品深加工技术工程中心，天津 300392)

南瓜又称番瓜、楼瓜、金冬瓜，为葫芦科蔓生藤本植物南瓜果实，原产亚洲南部、非洲和南美洲地区[1]。南瓜中富含氨基酸、蛋白质、纤维素及维生素等多种营养成分[2-5]。其中多糖类物质是具有保健功能的生物活性成分。研究表明，南瓜多糖具有抗氧化[6]、抗肿瘤[7]、降血压、血糖及血脂作用[8-9]。目前，有关南瓜多糖的研究主要集中在南瓜多糖的分离提取、生物活性及结构研究等方面，对其生物转化的研究尚未见报道。

生物转化[10]是利用植物离体细胞或器官、动物细胞、微生物及其细胞器，以及游离酶对外源性化合物进行结构修饰而获得有价值产物的生理生化反应，其中应用最广泛的生物转化技术是利用微生物体系进行化合物的结构修饰[11]。乳酸菌是一类细菌的统称，这些细菌能够利用碳水化合物生成乳酸[12-13]。植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)是乳酸菌的一种，主要用于食品、乳制品、肉类和蔬菜的发酵。Gao等[14]利用从传统泡菜中分离的植物乳杆菌NCU116对苦瓜多糖进行生物转化，明显改善了T2DM模型大鼠高血糖、高胰岛素、高血脂和氧化应激水平，并且提高了肠道菌群中Lactococcuslaudensis和Prevotellaloescheii的丰度，降低了肠道pH值。张志红[15]通过植物乳杆菌NCU116发酵芦笋浆，探讨了发酵芦笋多糖和芦荟多糖的理化性质和体内体外活性变化，发现发酵芦笋多糖的抗氧化能力得到了增强，并提高了其免疫活性，小鼠药物性肝损伤得到了一定修复。Lee等[16]研究发现，植物乳杆菌生物转化后的铁钉菜多糖在体外具有更强的DPPH自由基和羟自由基清除能力，在体内也可减少由伽玛射线辐照引起的氧化应激斑马鱼的卵黄囊水肿和尾巴弯曲畸形，提高斑马鱼的存活率。彭兴兴等[17]将乳酸菌应用到南瓜中制成南瓜乳酸发酵饮料，并取得了一定研究成果，但大部分研究主要集中于工艺优化方面[18]，或者是对乳酸菌发酵南瓜风味物质的研究，而对乳酸菌生物转化南瓜多糖提高其生物活性方面的研究尚未见报道。

研究拟通过植物乳杆菌生物转化南瓜多糖，并对其工艺条件进行优化，旨在为促进南瓜资源合理深加工，提高其利用效能提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

南瓜：市售；

植物乳酸杆菌nbkBC299：诺佰克(武汉)生物科技有限公司；

MRS肉汤培养基：北京索莱宝科技有限公司；

其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

高速冷冻离心机：LGR20-W型，北京京立离心机有限公司；

旋转蒸发仪：DLK-5003型，宁波新芝生物科技有限公司；

立式压力蒸汽灭菌器：BXM-30R型，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；

电子天平：AX224ZH型，奥豪斯仪器(常州)有限公司；

洁净工作台：SW-CJ-2FD型，苏州安泰空气技术有限公司；

紫外可见分光光度计：UV-1200型，上海沪粤明科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 植物乳杆菌生物转化南瓜多糖工艺流程

成熟南瓜→去皮去瓤→打浆→冷冻干燥→南瓜粉→溶解→灭菌(115 ℃、20 min)→冷却→接种→发酵→冷冻干燥→发酵南瓜粉→溶解→多糖提取→浓缩→醇沉→离心→冷冻干燥→南瓜多糖冻干粉

1.3.2 多糖提取率测定根据池源等[19]的方法，并按式(1) 计算多糖提取率。

(1)

式中：

R1——多糖提取率，%；

c——多糖的质量浓度，g/L;

v——多糖液体体积，mL;

n——稀释倍数；

m——样品质量，g。

1.3.3 DPPH自由基(DPPH·)清除率测定参照韦献雅等[20]的方法，并按式(2)计算DPPH·清除率。

(2)

式中：

R2——自由基清除率，%；

Ai——样品测定管的吸光度；

Aj——空白对照组的吸光度；

A0——样品对照组的吸光度。

1.3.4 羟基自由基(OH·)清除率测定参照程龙[21]的方法，并按式(2)计算OH·清除率。

(3)

式中：

Ai——样品测定管的吸光度值;

A0——样品溶剂(蒸馏水)代替样品测定的吸光度。

1.3.6 铁离子还原力测定参照雷兵[22]的方法。

1.3.7 植物乳杆菌生物转化南瓜多糖单因素试验

(1) 摇床转速：固定料液比1∶20 (g/mL)，接种量1%，温度37 ℃，考察摇床转速(50，100，150，200 r/min)对多糖提取率和DPPH·清除率的影响。

(2) 温度：固定料液比1∶20 (g/mL)，接种量1%，转速50 r/min，考察温度(28，32，37，42 ℃)对多糖提取率和DPPH·清除率的影响。

(3) 料液比：固定接种量1%，摇床转速50 r/min，温度37 ℃，考察料液比[m南瓜粉∶V蒸馏水分别为1∶10，1∶20，1∶30，1∶40 (g/mL)]对多糖提取率和DPPH·清除率的影响。

(4) 接种量：固定料液比1∶20 (g/mL)，摇床转速50 r/min，温度37 ℃，考察接种量(0.5%，1.0%，1.5%，2.0%)对多糖提取率和DPPH·清除率的影响。

1.3.8 植物乳杆菌生物转化南瓜多糖正交试验在单因素试验基础上选择摇床转速、温度、料液比、接种量4个因素，利用L9(34)正交表设计试验，进一步优化植物乳杆菌生物转化南瓜多糖工艺。

1.4 数据处理

利用Excel软件对数据进行处理和统计，结果以“x±S”表示。利用SPSS 22.0软件对数据进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 植物乳杆菌生物转化南瓜多糖菌种筛选

由图1可知，生物转化南瓜多糖对DPPH·的清除率效果最佳的3组为植物乳杆菌nbkBC299摇床发酵48 h>植物乳杆菌nbkBC299静止发酵48 h>未发酵南瓜静止24 h，说明通过植物乳杆菌的生物转化作用可以提高南瓜多糖的体外抗氧化活性。

1. 植物乳杆菌nbkMA2静止发酵24 h 2. 植物乳杆菌nbkBC299静止发酵24 h 3.未发酵南瓜静止24 h 4. 植物乳杆菌nbkMA2静止发酵48 h 5. 植物乳杆菌nbkBC299静止发酵48 h 6. 未发酵南瓜静止48 h 7. 植物乳杆菌nbkMA2摇床发酵24 h 8. 植物乳杆菌nbkBC299摇床发酵24 h 9. 未发酵南瓜摇床24 h 10. 植物乳杆菌nbkMA2摇床发酵48 h 11. 植物乳杆菌nbkBC299摇床发酵48 h 12. 未发酵南瓜摇床48 h 字母不同表示差异显著(P<0.05)图1 植物乳杆菌nbkMA2和nbkBC299转化南瓜多糖对DPPH·清除率的影响Figure 1 Effects of pumpkin polysaccharides transformed by Lactobacillus plantae nbkMA2 and nbkBC299 on DPPH free radical scavenging rate

2.2 植物乳杆菌生物转化南瓜多糖单因素试验

2.2.1 摇床转速对植物乳杆菌生物转化南瓜多糖的影响

由图2可知，生物转化南瓜多糖提取率随摇床转速的升高逐渐降低，当摇床转速为50 r/min时南瓜多糖提取率最高为(55.19±0.32)%，显著高于摇床转速为100～200 r/min时的(P<0.05)，主要是由于摇床的机械撞击作用导致南瓜细胞越来越容易被破坏，多糖暴露于细胞外，使菌种更好利用多糖，从而分解多糖，故提取率下降[23]。随着摇床转速的提高，南瓜多糖对DPPH·的清除率呈先上升后下降趋势，当摇床转速为100 r/min时，南瓜多糖对DPPH·清除率最高为(44.40±0.22)%，且显著高于其他条件下的(P<0.05)，由于转速过快，多糖暴露于细胞外而被过多分解成单分子糖类物质，可能造成其对DPPH·清除率的下降。综上，选取摇床转速50，100，150 r/min进行正交试验。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图2 摇床转速对南瓜多糖提取率和 DPPH·清除率的影响Figure 2 Effects of shaking speed on extraction rate and DPPH·scavenging rate of pumpkin polysaccharide

2.2.2 温度对植物乳杆菌生物转化南瓜多糖的影响由图3可知，不同温度下的生物转化南瓜多糖提取率无显著差异。当温度为37 ℃时，生物转化南瓜多糖对DPPH·清除率最高为(40.37±0.17)%，且显著高于其他条件下的(P<0.05)，可能是因为27～37 ℃温度较低，对多糖结构未产生明显影响，多糖类物质[24-25]未被破坏，导致其对DPPH·清除率逐渐升高，随着温度的升高，多糖结构发生一定的改变而导致活性下降，DPPH·清除率也随之下降。综上，选取温度32，37，42 ℃进行正交试验。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图3 温度对南瓜多糖提取率和DPPH·清除率的影响Figure 3 Effects of temperature on extraction rate and DPPH·scavenging rate of pumpkin polysaccharide

2.2.3 料液比对植物乳杆菌生物转化南瓜多糖的影响

由图4可知，生物转化南瓜多糖提取率随料液比的增大逐渐降低，当料液比为1∶10 (g/mL)时南瓜多糖提取率最高，与料液比为1∶20～1∶40 (g/mL)时有显著差异(P<0.05)，可能是由于南瓜细胞或组织内外浓度差随料液比的增加而减小，不利于南瓜多糖向溶液中扩散，因此南瓜多糖提取率逐渐降低[26]，而当料液比为1∶20 (g/mL) 时生物转化南瓜多糖对DPPH·清除率显著高于其他料液比的(P<0.05)。综上，选取料液比为1∶10，1∶20，1∶30 (g/mL)进行正交试验。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图4 料液比对南瓜多糖提取率和DPPH·清除率的影响Figure 4 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate and DPPH·scavenging rate of pumpkin polysaccharide

2.2.4 接种量对植物乳杆菌生物转化南瓜多糖的影响

由图5可知，生物转化南瓜多糖提取率随植物乳杆菌接种量的增大逐渐降低，当接种量为0.5%时南瓜多糖提取率最高，与接种量为1.0%时相比无显著性差异，但与接种量为1.5%～2.0%时相比差异显著(P<0.05)。可能是因为乳酸菌可以产生如β-半乳糖苷酶、α-糖苷酶、α-葡糖苷酶以及α-甘露糖苷酶等相关的碳水化合物活性酶，降解南瓜多糖。当接种量为1.5%时，生物转化南瓜多糖对DPPH·的清除率最高为(40.78±0.20)%，显著高于接种量为0.5%～1.0%时的(P<0.05)，可能是较大的接种量对南瓜多糖分解过度产生了更多的小分子糖类物质，从而造成DPPH·清除率下降。综上，选取接种量为1.0%，1.5%，2.0%进行正交试验。

字母不同表示差异显著(P<0.05)图5 接种量对南瓜多糖提取率和DPPH·清除率的影响Figure 5 Effects of inoculation amount on extraction rate of pumpkin polysaccharide and DPPH·clearance rate

2.3 植物乳杆菌生物转化南瓜多糖正交试验

根据单因素试验结果，选用L9(34)正交表，以DPPH·清除率为考察指标，对植物乳杆菌生物转化南瓜多糖工艺条件进行优化。各因素水平见表1，正交试验设计及结果见表2。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Table of orthogonal test factors

由表2可知，各因素对DPPH·清除率的影响主要次序为摇床转速>料液比>温度>接种量，微生物转化南瓜多糖最优工艺组合为A2B3C3D2，即摇床转速100 r/min，温度42 ℃，料液比1∶30 (g/mL)，接种量1.5%，此条件下的生物转化南瓜多糖对DPPH·的清除率为(47.95±0.19)%；表2中试验5的DPPH·清除率最高，其生物转化条件为摇床转速100 r/min，温度37 ℃，料液比1∶30 (g/mL)，接种量1.0%，此时DPPH·清除率为(54.61±1.58)%；因此植物乳杆菌生物转化南瓜多糖最佳工艺条件为摇床转速100 r/min，温度37 ℃，料液比1∶30 (g/mL)，接种量1.0%。

表2 正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal test results