动态高压微射流协同美拉德反应对α-乳白蛋白结构和功能性质的影响

杨 萍 涂宗财,3 刘 俊 邵艳红 谢雅雯 沙小梅 张 露

(1. 江西师范大学功能有机小分子教育部重点实验室，江西 南昌 330022；2. 江西师范大学生命科学学院,江西 南昌 330022；3. 南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047)

α-乳白蛋白(α-lactalbumin,α-LA)属于溶菌酶家族，结构呈球形，其单体由123个氨基酸组成，分子量约为14.2 kDa。α-LA是乳清蛋白中唯一能结合钙离子的蛋白，且4个天冬氨酸残基均能结合钙离子，其独特的氨基酸序列和三维结构赋予α-LA突出的功能特性和生物学活性，使其在食品、医药、化妆品等行业广泛应用[1]。在临床领域，α-LA 具有抗氧化、降血压、抗癌、降血脂、抗病毒、抗菌、螯合金属等作用[2]。

目前，许多改性方法如辐照[3]、美拉德[4]、热处理[5]等，用于提高α-LA的功能性质。而动态高压微射流(Dynamic high pressure microfluidization，DHPM)是一种集高速碰撞、高频振荡、瞬时压力降、强剪切、气穴作用和超高压作用为一体的新兴高压加工技术，被广泛用于生物大分子的改性[6]。研究发现DHPM预处理能诱导牛血清白蛋白(BSA)的结构发生去折叠，从而促进蛋白质的美拉德反应，提高BSA的美拉德反应程度[7]。此外美拉德反应是一种蛋白质的游离氨基和还原糖的羧基之间的化学反应，能改善蛋白质的功能性质，如卵清蛋白经美拉德反应修饰后，其乳化性、起泡性得到显著改善[8]。然而，对DHPM结合美拉德反应改性α-LA的研究较少。

本研究拟以α-LA为研究对象，采用DHPM结合美拉德反应对α-LA进行复合改性，研究改性后的结构、乳化特性和抗氧化活性，为拓宽α-LA在食品工业中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

牛乳α-LA：L-6010，美国Sigma-Aldrich公司；

乳糖、邻苯二甲醛(OPA)、8-苯胺-1-萘磺酸(ANS)、十二烷基磺酸钠、β-巯基乙醇：分析纯，索莱宝试剂有限公司；

大豆油：市售；

碘化钾、甲醇：分析纯，西陇科学股份有限公司；

硼砂：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；

乳糖：分析纯，阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

紫外可见分光光度计：U-3200型，日本日立公司；

荧光分光光度计：F-7000型，日本日立公司；

纳米超高压均质机：NCJJ-0.007/200型，廊坊通用机械有限公司；

圆二色谱仪：MOS 450型，法国Bio-Logic公司；

冷冻干燥机：LGJ-1D-80型，北京亚泰科隆仪器技术有限公司；

旋涡混合仪：WH-866型，上海骥辉科学分析仪器有限公司；

酶标仪：SynergyH1型，美国Bio Tek公司。

1.2 方法

1.2.1 样品制备 称取一定质量的α-LA，溶于磷酸盐缓冲溶液(PBS)，配制成浓度为1 mg/mL的溶液。经微射流均质机处理，均质压力分别为0，80，110，140 MPa，常温下处理3次，收集溶液，取其中一部分溶液加入等质量的乳糖，混匀，分装冻干，分别记为LA-0-Lac、LA-80-Lac、LA-110-Lac、LA-140-Lac，余下溶液不加糖，分别记N-LA、LA-80、LA-110、LA-140，分装冻干冷藏备用。将冻干后的样品置于培养箱中，在55 ℃，相对湿度65%的条件下反应8 h，反应结束后将离心管置于冰浴中终止反应。4 ℃储存备用。

1.2.2 SDS-PAGE 根据文献[9]。

1.2.3 接枝度的测定 根据文献[10]。用相同的方法，以赖氨酸代替样品做标准曲线，以吸光度为纵坐标(y)，游离氨基含量为横坐标(x)，绘制标准曲线方程为y=1.287x+0.007。

1.2.4 内源荧光性测定 根据文献[11]。

1.2.5 表面疏水性测定 根据文献[12]。

1.2.6 圆二色谱分析 根据文献[11]。

1.2.7 乳化性测定 根据文献[13]。

1.2.8 ABTS+·清除能力 根据文献[14]。

1.3 数据处理

本试验均重复3次，所得试验数据采用SPSS17.0软件进行显著性分析(P<0.05)，Origin 8.6软件作图。

2 结果与分析

2.1 SDS-PAGE

图1为DHPM预处理结合美拉德改性对α-LA分子量的影响。由图1可知，α-LA的分子量在14.4 kDa左右，与N-LA相比，LA-80、LA-110和LA-140的电泳条带均无明显变化。α-LA与乳糖混合样品的条带均上移，说明α-LA与乳糖发生了共价结合，分子量增加；然而，LA-0-Lac、LA-80-Lac、LA-110-Lac和 LA-140-Lac条带之间没有显著差别。此外所有的样品在31 kDa附近出现明显条带，这是因为α-LA 在美拉德反应过程中分子之间发生了聚合，形成了二聚体[15]。

M. Marker蛋白 1. N-LA 2. LA-80 3. LA-110 4. LA-1405. LA-0-Lac 6. LA-80-Lac 7. LA-110-Lac 8. LA-140-Lac图1 DHPM预处理结合美拉德改性前后α-LA的 SDS-PAGE电泳图

Figure 1 SDS-PAGE ofα-LA treated by DHPM pretreatment combined with Maillard reaction

2.2 接枝度的测定

游离氨基含量能够用来评价美拉德反应的程度[16]，并以接枝度的形式表示。如图2所示，LA-80-Lac、LA-110-Lac和 LA-140-Lac的接枝度均大于LA-0-Lac，且随着处理压力的增大，样品的接枝度显著增加(P<0.05)。表明DHPM预处理能够促进美拉德反应，原因是高压作用改变了α-LA的空间构象，暴露出更多的反应位点，提高了美拉德反应程度[7]。当压力达到110 MPa时，LA-110-Lac的接枝度达到最大，说明美拉德反应程度达到最大。但当处理压力大于110 MPa 时，LA-140-Lac的接枝度显著降低(P<0.05)，可能是过大的压力作用使α-LA空间结构发生改变，且美拉德反应促进了蛋白质的聚合反应，掩盖了部分反应基团[17]，降低其接枝度。

不同字母表示差异显著(P<0.05)图2 DHPM预处理结合美拉德反应对α-LA接枝度的影响

Figure 2 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the degree of grafting ofα-LA

2.3 内源性荧光测定

内源性荧光是检测蛋白质三级结构常用的方法。图3为不同处理压力结合美拉德反应对α-LA内源性荧光的影响。经DHPM处理后，α-LA的荧光强度先升高后降低。这是因为DHPM的高速碰撞、高频振荡、强剪切、气穴作用等，破坏了α-LA的空间结构，导致隐藏在蛋白质分子内部的Trp更多地暴露在极性环境中，从而增加α-LA荧光强度。当压力超过110 MPa，LA-140荧光强度降低，与Maresca等[18]的研究结果类似。经乳糖美拉德反应后，LA-Lac体系的荧光强度显著降低，可能是因为α-LA与乳糖的结合对部分色氨酸起到了屏蔽作用。且随处理压力的增大，荧光强度先增后减，LA-110-Lac的荧光强度达最低，可能是LA-110-Lac的美拉德反应程度最大，结合的乳糖最多，对色氨酸产生了更强的屏蔽效应。

图3 DHPM预处理结合美拉德反应对α-LA内源性 荧光的影响

Figure 3 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the intrinsic fluorescence intensity ofα-LA

2.4 表面疏水性测定

图4为α-LA的表面疏水性指数，经DHPM改性后，LA-80、LA-110和LA-140的H0较N-LA显著增大(P<0.05)。这和Ruan等[17]的研究结果一致，可能是压力作用使α-LA构象发生变化，内部疏水性基团部分暴露，H0增大。但经140 MPa处理后，H0相较110 MPa处理有所下降，可能是蛋白质分子之间存在疏水作用，当暴露的疏水基团较多时，会通过疏水作用重新聚合[19]。处理后的α-LA与乳糖发生美拉德反应后，LA-Lac的H0较LA的显著增加(P<0.05)，且随着压力的逐渐增加，H0先显著增加后降低(P<0.05)。这可能是α-LA与乳糖发生接枝反应，α-LA 结构发生改变，暴露了蛋白质分子内部的疏水性基团[20]，掩盖了周围的亲水性基团[21]，增加了H0。当压力达到110 MPa，LA-110-Lac的H0达到最大值。

不同字母表示差异显著(P<0.05)图4 DHPM预处理结合美拉德反应对α-LA表面 疏水性的影响

Figure 4 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the surface hydrophobicity ofα-LA

2.5 圆二色光谱分析

采用圆二色光谱分析α-LA二级结构中各组分的含量。由图5可知，DHPM预处理对α-LA二级结构中各组分的含量没有显著影响，与Subirade等[22]的结论相似；这也可能是α-LA 结合钙离子，使其二级结构更加稳定[23]。美拉德反应后的结果见图6和表1，α-LA的α-螺旋含量升高、转角和无规卷曲的含量降低，但样品LA-0-Lac、LA-80-Lac、LA-110-Lac和 LA-140-Lac二级结构各组分之间没有明显差别，可能是因为不同的压力处理方式对α-LA的二级结构影响不大。此外Liu等[24]研究发现蛋白质二级结构组分变化与还原糖的分子量、蛋白质和还原糖的质量比、美拉德反应的时间长短有关。说明LA-0-Lac、LA-80-Lac、LA-110-Lac和 LA-140-Lac的二级结构变化不明显可能是样品发生美拉德反应的条件一样。

图5 DHPM处理对α-LA二级结构的影响Figure 5 Effect of DHPM treatment on the secondary structure of α-LA

图6 DHPM预处理结合美拉德反应对α-LA二级 结构的影响

Figure 6 Effect of DHPM pretreatment combined with Maill-ard reaction on the secondary structure ofα-LA

表1 DHPM预处理结合美拉德反应对α-LA二级结构含量的影响†Table 1 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the secondary structure content of α-LA %

† 同列上标字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2.6 乳化性测定

食品中蛋白质的乳化性一般通过乳化活性(EAI)和乳化稳定性(ESI)来评价。图7为DHPM预处理结合美拉德反应对α-LA乳化性的影响。经DHPM预处理后，α-LA的EAI和ESI呈先升后降的趋势，当处理压力达到110 MPa，LA-110的乳化性最大。这可能是DHPM的瞬时高压作用，使得蛋白质空间结构发生变化，极性侧链的水合作用增强，亲水性提高；与此同时一些原先被包埋在分子内部的疏水性基团暴露出来，亲油性增强，两者达到较好的平衡，乳化性能增强[25]。但当压力高于110 MPa时，α-LA形成分子聚集体，表面疏水性减弱，水油平衡能力减弱，乳化能力下降。经乳糖美拉德后，α-LA的乳化性显著增大(P<0.05)，可能是α-LA与乳糖产生高分子量的糖结合物，它能与疏水性蛋白质共轭结合，并牢固地吸附在水-油界面，同时亲水性的糖类物质可以高度溶解于水相介质，从而提高蛋白质的乳化性质[26]。当DHPM处理压力达到110 MPa时，LA-110-Lac的EAI和ESI最大。这可能是110 MPa时，美拉德反应程度最大，蛋白质接枝上更多的糖类，生成更多的美拉德产物。当压力超过110 MPa，美拉德反应程度降低，产生较少的蛋白质-糖结合物，EAI和ESI值降低。

不同字母表示差异显著(P<0.05)图7 DHPM预处理结合美拉德反应对α-LA乳化性的影响

Figure 7 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the emulsibility properties ofα-LA

2.7 ABTS+·清除能力

ABTS+·清除能力可以反映美拉德产物的抗氧化活性。不同DHPM处理压力结合美拉德反应对α-LA的ABTS+·清除能力影响见图8。经DHPM预处理后，α-LA的ABTS+·清除能力没有显著性差异(P>0.05)，说明DHPM对α-LA的ABTS+·清除能力没有显著影响。而经乳糖美拉德后α-LA的ABTS+·清除能力显著提高(P<0.05)，可能是α-LA与乳糖产生的美拉德产物和ABTS+·反应，使得α-LA体系的正离子自由基含量减少，导致蛋白质

不同字母表示差异显著(P<0.05)图8 DHPM预处理结合美拉德反应对α-LA 抗氧化活性的影响

Figure 8 Effect of DHPM pretreatment combined with Maillard reaction on the antioxidative activity ofα-LA

的抗氧化能力增加[27]。随着DHPM压力的增加，ABTS+·清除能力先增加后降低，处理压力为110 MPa时，LA-110-Lac的自由基清除率达到最大，这是由于DHPM促进了α-LA 与乳糖的美拉德反应，生成更多的美拉德产物。当处理压力为140 MPa，美拉德反应程度降低，生成的美拉德产物含量减少，且文献报道色氨酸具有自由基清除能力，而美拉德反应的加热条件会降低色氨酸的自由基清除能力[28]，因此LA-140-Lac的自由基清除率降低。

3 结论

DHPM预处理对α-LA的一级和二级结构无显著影响，而对其三级结构有显著影响。经DHPM预处理后α-LA的内源性荧光强度和表面疏水性增大，且呈先升后降的趋势，在处理压力为110 MPa的条件下达到最大。说明DHPM能改变α-LA的三级结构，诱导蛋白质内部的疏水性基团暴露，使其乳化性增强。相对N-LA，DHPM预处理结合乳糖美拉德改性后的α-LA，其乳化性和抗氧化活性增强，且随着处理压力的增大，呈先升高后降低的趋势，在处理压力为110 MPa时，乳化性和抗氧化活性最大。DHPM的作用使α-LA结构松驰，更易与乳糖结合，促进了美拉德反应，生成更多的美拉德产物，能更加牢固地吸附在水-油界面，增强乳化性；能和ABTS+·反应，减少正离子自由基，增强抗氧化活性。DHPM预处理结合乳糖美拉德反应可以改变α-LA结构并提高其乳化性能和抗氧化活性，可以为α-LA改性提供一种新的方法。