新疆喀什长寿老人肠道益生菌的分离鉴定及生物学特性研究

阿依米热·毛拉木 努斯热提古丽·安外尔 布沙热木·阿布力孜 海米代·吾拉木 乌斯满·依米提

(新疆大学生命科学与技术学院，新疆 乌鲁木齐 830046)

人体肠道是微生物良好的栖息环境，成人肠道中的微生物数量多达1013～1014个、共15 000～36 000种，总重量达1.5 kg[1]。肠道微生物是人体最庞大、最复杂的微生态系统，具有人体不具备的代谢功能。肠道微生物及其代谢产物不仅能提供营养、促进消化[2]，还能抑制病原体的侵袭[3]、影响免疫系统发育和大脑活动[4]。Komai等[5]研究发现，长寿老人肠道内的双歧杆菌、乳杆菌等乳酸菌数量多于普通人群，说明肠道中的乳酸菌对人体的健康和长寿有一定的促进作用。但是肠道菌群结构失调会导致肥胖、糖尿病、冠心病等慢性疾病的发生[6-7]。益生菌和益生元是调理肠道微生物群落结构的两大肠道活力因子。益生菌是对宿主有益的一类微生物活体，它定植于人体肠道和生殖系统，能够产生一定的功效从而改善宿主的微生态平衡，发挥有益作用。大量研究[8-9][10]23-24发现乳酸菌在降低血清中的血脂水平方面具有显著功能，并且副作用较低。尽管乳酸菌对人体的有益作用较为突出，由于不同人的肠道菌群之间存在差异[11]，宿主与肠道微生物菌群之间存在着相互选择的关系，因此不同人群对同种菌株的适应性及不同来源菌株对人体肠道的适应能力不同[12]。目前中国的益生菌产品多以非人源益生菌为主，忽略了菌株的来源与作用对象一致时，菌株对宿主益生功效的针对性和特异性才会增强[13]。

本试验拟从世界公认的长寿地区喀什长寿老人肠道中分离筛选降甘油三酯乳酸菌，通过体外试验获得对胃酸和胆汁盐具有一定耐受性的人源益生菌，对人体肠道具有更高的适应性和安全性等优点，可以将其直接应用于人体或乳制品，为开发和利用人源益生菌提供菌种资源储备和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 样品

2016年2月从喀什地区疏勒县库木西力克乡采集长寿(80岁以上)老人粪便样品一共10份。库木西力克乡是长寿老人集中的乡村，提供样品者长期饮食结构大多以牛奶、羊肉为蛋白质的主要来源，日常食物有小麦、玉米和高粱，水果和坚果是每日必不可少的部分。样品提供者均为长期坚持农业生产劳动的农民。对照组为普通农民的粪便一共2份，并保证采样前2周内没有服用过任何菌类药物，样品信息见表1。

表1 样品信息Table 1 The information of samples

1.1.2 试剂及培养基

甘油三酯试剂盒(TG)、胆盐：四川迈克生物科技股份有限公司；

细菌基因组DNA提取试剂盒、溶菌酶、Taq聚合酶：上海生工生物工程股份有限公司；

改良MRS培养基：蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸二铵2 g，葡萄糖20 g，牛肉膏10 g，无水乙酸钠5 g，硫酸镁0.2 g，硫酸锰0.05 g，琼脂粉20 g，碳酸钙20 g，吐温1 mL；

LB培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸出粉5 g，氯化钠10 g，琼脂粉18 g；

甘油三酯培养基：将2 g/L的聚乙烯醇水溶液与植物油按体积比3∶1混合，用超声波处理(控制参数每次超声5 s，间隔时间5 s，共超声70次)后，加入到MRS培养基中，调pH至6.5±0.2，121 ℃灭菌15 min，冷却备用；

人工胃液：5 g/L的NaCl溶液、3 g/L的胃蛋白酶溶液，用1.0 mol/L的HCl调pH至3.0，0.22 L滤器过滤除菌[10]，4 ℃冰箱冷藏，备用；

胆盐培养基：称取胆盐于MRS 液体培养基中，配制浓度为成1，3，5 g/L胆盐溶液[10]35，调pH至6.5±0.2，121 ℃灭菌15 min，冷却备用。

1.1.3 主要仪器

全自动灭菌锅：JF-SX-500型，日本TOMY公司；

生化培养箱：DP-200型，上海精宏实验设备有限公司：

分光光度计：NanoDrop 2000c型，赛默飞世尔科技公司；

PCR仪：S1000 Thermal Cycler型，北京伯乐元业有限责任公司；

电子天平：JD200-3型，沈阳龙腾电子称量仪器有限公司；

凝胶成像：bioradchemidoc XRS型，美国伯乐公司。

1.2 方法

1.2.1 长寿老人与普通人细菌总数的测定及比较 分别称取1.0 g长寿老人和普通人粪便样品，倒入9.0 mL无菌水中，吸取稀释液1 mL进行梯度稀释，得到10-2～10-5个稀释度，涂布于LB培养基，37 ℃倒置培养48 h，观察菌株生长情况，记录菌落总数，进行比较。在改良MRS培养基上进行分离，挑选形成钙溶圈的菌落，2组进行乳酸菌数量比较。

1.2.2 乳酸菌的分离、纯化及形态学观察 将新疆喀什地区维吾尔族长寿(80岁以上)老人采集的粪便样品梯度稀释，平板涂布于改良MRS培养基上，37 ℃倒置培养48 h，根据菌落形态将不同菌落进行编号，并挑取形态不同的菌落反复划线于LB培养基分离获得纯菌落。对分离获得的41株菌株进行革兰氏染色试验、过氧化氢酶接触试验。将革兰氏染色结果为阳性且过氧化氢酶为阴性的菌株初步判断为乳酸菌[14]。

1.2.3 乳酸菌体外甘油三酯降解率、耐酸耐胆盐能力的测定

将乳酸菌按3%的接种量接种至甘油三酯培养基中，37 ℃ 培养24 h，10 000×g离心2 min，取上清液用于甘油三酯降解率的测定，以没有接菌的甘油三酯培养液作为空白对照，利用甘油三酯试剂盒测定甘油三酯的含量[15]。甘油三酯含量和甘油三酯降解率分别按式(1)、(2)计算：

(1)

(2)

式中：

C1——样品的甘油三酯含量，mg/mL；

A1——接种乳酸菌的含甘油三酯的MRS液体培养基中测得的甘油三酯OD值；

A2——标准液的OD值；

C——标准液的含量，mg/mL；

R——甘油三酯降解率，%；

C2——总甘油三酯含量，mg/mL。

将1.0 mL乳酸菌菌液接种至9.0 mL pH为3.0的人工胃液中，37 ℃厌氧培养，依次在0，3 h时进行取样，测定活菌数，存活率按式(3)计算：

(3)

式中：

在实验中，我们将事先录好的铁路监控视频，作为输入图像导入到关键帧提取器，通过SIFT特征提取和卷积神经网络的深度特征提取，自动调整网络参数和权重，实现基于深度学习的目标检测提取视频图像关键帧，提取出视频的关键帧图像如图4所示。

S——存活率，%；

N1——3 h的活菌数，CFU/mL；

N2——0 h的活菌数，CFU/mL。

将乳酸菌按3%的接种量分别接种至含1，3，5 g/L的胆盐培养基中，37 ℃厌氧培养，依次在0，3 h时进行取样，测定活菌数，按式(3)计算存活率。

1.2.4 16S rDNA序列鉴定 参照DNA提取试剂盒方法，提取乳酸菌基因组DNA，对乳酸菌的16S rDNA进行PCR扩增，将扩增产物交由上海生工进行序列测定，得到的序列通过BLAST程序比对，鉴定菌属信息。

将提取所得的DNA模板进行PCR扩增，采用正向引物27f:5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，反向引物1492R:5，-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3。PCR反应体系(50 mL)：各引物1 mL；mix 24 mL；模板1 mL；超纯水补足至50 mL。PCR反应条件为：94 ℃ 3 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，33个循环，最后72 ℃延伸5 min。取扩增产物6 mL，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳液为0.5%×TBE。

1.3 数据统计与处理

利用SPSS 19.0软件对试验数据进行分析。每组试验至少重复3次，结果用均值±标准差表示。Prism 5作图，采用单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 细菌总数的测定

表2为新疆喀什长寿老人和普通人肠道中可培养细菌和乳酸菌总数的比较。由表2可以看出，长寿老人肠道中的细菌总数比普通人的少，但长寿老人肠道中乳酸菌占的比例显著高于普通人的。麦热姆妮萨·艾麦尔等[16]研究发现，

表2 样品的细菌总数Table 2 Total bacterial count

和田长寿老人的肠道益生菌在数量和种类上均与普通人群有差异，且长寿老人肠道内的益生乳酸菌的数量比普通人群肠道内的多，主要是肠球菌和植物乳杆菌占优势。研究[5,17-18]显示中国巴马地区和俄罗斯高加索长寿地区人群肠道中的益生乳酸菌数量明显高于普通人。表明人的健康与长寿均与肠道中的益生乳酸菌相关，与本研究结果一致。

2.2 乳酸菌的分离、纯化及初步鉴定

利用改良MRS培养基从长寿老人组分离得到41株乳酸菌，各菌落皆为乳白色，表面光滑、整齐，形成钙溶圈，直径为1～3 mm；皆为革兰氏阳性，形状为杆状、短杆状或球状，均为过氧化氢酶阴性。

2.3 乳酸菌的体外降甘油三酯能力的测定

由表3可知，不同来源的乳酸菌的甘油三酯降解率差异较大，41株乳酸菌中，A1-2和A1-10的甘油三酯降解能力最强，降解率分别为39.38%，32.33%。其次有12株菌的降解率在15%～30%，18株菌在5%～15%，9株菌在5%以下。

表3 乳酸菌降解甘油三酯的能力Table 3 Abilities of lowering riglycerids by lactic acid bacteria

2.4 乳酸菌耐酸耐胆盐能力的测定

将14株甘油三酯降解率>15%的乳酸菌接入pH为3.0 的人工胃液中，37 ℃厌氧培养，分别在0，3 h时进行取样，测定活菌数并计算存活率。由图1(a)可以看出，乳酸菌在pH为3.0的人工胃液中存活率均超过12.00%，其中A2-1、A1-2、A3-1、A4-6及A4-1的存活率>50%，分别为63.22%，60.01%，58.94%，56.14%，50.29%。乳酸菌能够在酸性条件下存活，可能是因为其细胞质中的pH值始终保持在一个适宜的水平，而F1F0-ATP酶在维持乳酸菌细胞内的pH 起到至关重要的作用[19]，人体肠道中的低pH 环境也增加了F1F0-ATP酶的活性[20]，因此，试验中不同乳酸菌耐酸能力有较大的差异，可能与菌体的来源，即个体肠道内环境的差异有一定的关系[21]。

不同字母表示具有差异性(P<0.01)图1 乳酸菌在初始pH为3.0及1，3，5 g/L胆盐溶液中的存活率Figure 1 The survival rate of lactic acid bacteria in the initial pH of 3.0 and 1, 3, 5 g/L bile salt solution (n=3)

由图1(b)～(d)可以看出，在1，3，5 g/L 胆盐溶液中的存活率>10.00%的菌株共6株，为A1-2、A2-2、A3-1、A2-1、A1-8及A4-6，这6株菌的耐胆盐能力显著大于其他菌株(P<0.01)。同一菌株随着胆盐浓度的升高，存活率反而降低。

2.5 菌株16S rDNA测序鉴定

对耐酸耐胆盐能力较强的5株乳酸菌基因组DNA进行PCR扩增，电泳检测扩增产物，送去上海生工测序。应用BLAST对得到的序列进行比对，从GenBank中选取相关种属菌株16S rDNA序列，应用Cluxtal X双重比对，用MEGA 5.0软件进行相似性分析(表4)及系统发育树分析(图2)。结果表明，A1-2与植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，A2-1，A3-1，A4-6与屎肠球菌(Enterococcusfaecium)，A4-1与干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)的同源性达到99%。

图2 5株分离菌根据相关16S rDNA序列建立的遗传进化树Figure 2 The genetic evolutionary tree of 5 isolated bacteria strain in accordance with the 16S rDNA sequences表4 16S rDNA序列比对鉴定结果Table 4 The identification result by alignment of 16S rDNA sequences

菌株亲缘关系最近的菌株同源性/%A1-2Lactobacillus plantarum99A2-1Enterococcus faecium99A3-1Enterococcus faecium99A4-6Enterococcus faecium99A4-1Lactobacillus paracasei99

3 结论

本研究从喀什长寿老人粪便中分离获得41珠乳酸菌，对其进行了降甘油三酯能力试验，筛选出14珠甘油三酯降解率>15%的菌株，进行胃酸，胆汁盐耐受试验。研究[22]表明，人的胃液pH值为3.0左右，空腹或食用酸性食品时的pH为1.50，小肠的胆汁盐含量为0.03%～0.30%。对酸和胆盐耐受性较低的乳酸菌在此环境下无法存活，因此从长寿老人样品中分离获得的乳酸菌具有较强的耐酸耐胆盐能力。其中A2-1，A1-2，A3-1，A4-6，A4-1在pH为3.0的人工胃液中有一定的耐受性，在人工胃液培养3 h的存活率分别为63.22%，60.01%，58.94%，56.14%，50.29%，并在胆盐浓度分别为1，3，5 g/L的MRS培养基中存活率较高，其中A1-2的耐胆盐能力最强，在胆盐浓度为1，3，5 g/L的MRS培养基中的存活率分别为46.03%，41.81%，15.77%。经分子鉴定可知，A1-2为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)，A2-1、A3-1、A4-6为屎肠球菌(Enterococcusfaecium)，A4-1为干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)。

通过研究发现菌株A1-2具有较强的耐酸耐胆盐能力，且该菌株为人源性，有较高的安全性，为以后的人源益生菌的开发提供新的菌种资源。