桦菌芝多糖抗氧化性及抑菌活性研究

许海燕 彭修娟 王 珊 刘 峰，2 刘艳红

(1. 陕西国际商贸学院医药学院，陕西 咸阳 712046；2. 陕西步长制药有限公司，陕西 西安 710075)

桦菌芝(Phropolyporusfomentarius)又名木蹄、木蹄层孔菌，真菌多孔菌科，褐层孔属植物木蹄的菌体，寄生于桦树树干上，广泛分布于中国东北、西北、华南等地区[1]。其性平，味微苦，有良好的消积化癖、抗癌作用，常用于治疗小儿食积、胃癌、子宫癌等疾病[2]。桦菌芝中化学成分多样，主要包括多糖、三萜类、酚类、蒽醌类、香豆素类、有机酸等[3]。目前，有关桦菌芝的研究主要集中于多糖、三萜等化学成分的提取工艺优化及多糖的抗肿瘤、提高免疫力等方面[1,4]，关于除多糖外的其他活性成分及多糖抗氧化、抗菌作用的研究尚未见报道。

多糖是由多个单糖缩合失水连接而成的高聚物[5]，几乎存在于所有动植物中。研究[6-7]表明，多糖具有很强的生物活性，可调控细胞分裂和分化，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗病毒等药理活性。多糖的抗氧化作用机制具有多途径、多靶点、多效应，主要是通过内源性抗氧化应激通路Nrf2-ARE通路，调节编码下游抗氧化酶基因的表达[8]。这些抗氧化酶能够阻断自由基链式反应，从而减少自由基的生成，消除过多自由基，从根源上防治疾病的产生。抑菌方面，多糖等植物提取物不仅能够选择性抑制外源性有害菌的生长，还能通过调控肠道微生物菌群的组成最终达到改善肠道功能和提高宿主免疫力的目的[9]。因此，通过研究植物提取物的抗氧化和抑菌作用，可从根源上防治疾病的产生及调节菌群抑制有害菌的生长，在开发药品、食品、保健品领域具有广阔的应用前景。

试验拟以桦菌芝为原料，采用水提取乙醇沉淀法提取分离桦菌芝多糖，分析其清除DPPH自由基和ABTS自由基能力，并用滤纸片法测定不同浓度桦菌芝多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和四联球菌的抑菌活性及最低抑菌浓度(MIC)，旨在为桦菌芝活性的进一步研究补充资料，也为其多糖的开发利用提供依据。

1 试验材料

1.1 试药与试剂

桦菌芝：陕西省商洛市镇安县，经陕西中医药大学杨新杰副教授鉴定为多孔菌科桦菌芝的菌体；

DPPH：分析纯，北京中生瑞泰科技有限公司；

ABTS：分析纯，上海华蓝化学科技有限公司；

无水乙醇：分析纯，上海红岩试剂厂；

BHT：分析纯，郑州超群化工食品有限公司；

抗坏血酸(VC)、过硫酸钾：分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；

试验用水均为纯化水；

大肠杆菌[CMCC(B)44102]、金黄葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草杆菌[CMCC(B)63501]、四联球菌[CMCC(B)72743]：中国微生物菌种保藏中心；

青霉素钠(A090702511)：河北新张药股份有限公司。

1.2 仪器与设备

植物粉碎机：FZ102型，上海洪纪仪器设备有限公司；

紫外—可见分光光度仪：UV-1800型，北京莱贝赛威科技有限公司；

电子天平：FA1004B型，苏州江东精密仪器有限公司；

电动离心机：80-1型，江苏中大仪器科技有限公司；

数显电热恒温水浴锅：DZKW-S-6型，成都一科仪器设备有限公司；

超声波清洗器：KO5200DE型，上海瑞兹仪器设备有限公司；

恒温培养箱：BPX-82型，上海博迅实业公司。

1.3 试验方法

1.3.1 桦菌芝多糖的制备 称取预处理后的桦菌芝药材粉末20 g，参照陈胜发等[10]的方法提取桦菌芝多糖。

1.3.2 抗氧化活性测定

(1) 供试品、对照品的制备：参照文献[11]的方法并修改。配制2.0 mg/mL的多糖样品溶液50 mL，再分别稀释成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6，1.8，2.0 mg/mL，待用，同浓度配制BHT和VC对照品溶液，供抗氧化活性测定。

(2) DPPH自由基清除活性的测定：参照文献[12]的方法并修改。取各浓度样品液2 mL，加入新配制的稳定DPPH自由基溶液(1×10-4mol/L) 2 mL，摇匀，共10组，室温下避光放置30 min，测定517 nm处吸光度值。以无水乙醇为空白对照，以BHT溶液和VC溶液为阳性对照，并按式(1)计算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

C——DPPH自由基清除率，%

Ai——多糖样品与DPPH自由基混合溶液吸光度；

Aj——多糖样品与无水乙醇混合溶液吸光度；

AO——DPPH自由基和无水乙醇混合溶液吸光度。

(3) ABTS自由基清除活性的测定：参照文献[13]的方法并修改。将ABTS溶液与不同浓度的多糖样品溶液按体积比19∶1配制成4 mL的混合溶液，摇匀，室温下避光放置6 min，测定734 nm处吸光度值，以无水乙醇为空白对照，以BHT和VC为阳性对照，并按式(2)计算ABTS+自由基清除率。

(2)

式中：

C——ABTS自由基清除率，%

A1——多糖样品与ABTS自由基混合溶液吸光度；

A0——多糖样品与无水乙醇混合溶液吸光度。

1.4 抑菌活性测定

1.4.1 菌种活化 选取大肠杆菌、金黄葡萄球菌、四联球菌、枯草杆菌4种菌种，在琼脂培养基上划线培养，37 ℃倒置培养24 h，连续2～3次。

1.4.2 供试品、对照品的制备 参照文献[14]的方法并修改。精密称取适量桦菌芝多糖溶于无菌水，使其浓度为10.0 mg/mL，用于抑菌活性测定；另取适量桦菌芝多糖溶于无菌水，配制成10.0 mg/mL的多糖样品溶液作为母液，采用连续稀释法，配制成5组不同浓度(0.625，1.250，2.500，5.000，10.000 mg/mL)桦菌芝多糖提取物溶液，用于最小抑菌浓度测定。称取1 g注射用青霉素钠干粉溶于100 mL氯化钠注射液中，得到浓度为10 mg/mL注射用青霉素钠溶液为阳性对照。

1.4.3 抑菌活性的测定 参照文献[15]的方法并修改。取直径为7 mm的滤纸片，于不同浓度的多糖溶液及对照品溶液中浸泡2 h，贴于琼脂平板中，37 ℃培养24 h。用浸有无菌水的滤纸片作为空白对照，青霉素钠为阳性药物对照。每菌种平行3个，测定抑菌圈直径。

1.4.4 最低抑菌浓度的测定(MIC) 参照延永等[16]的方法并修改。取 10.0 mL牛肉膏蛋白胨液体培养基、100.0 μL菌悬液(105～106 CFU/mL)和2.0 mL不同浓度桦菌芝多糖溶液于锥形瓶中，37 ℃下振荡培养24 h，测定517 nm处吸光度。吸光度为0的培养基中加入的秦岭龙胆提取物溶液为最低抑菌浓度(MIC)。

1.5 统计学分析

所有数据采用SPSS 17.0软件处理，采用邓肯氏法进行显著性分析，P<0.05为显著性差异。所有试验重复3次，结果以平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 抗氧化能力

2.1.1 清除DPPH自由基的能力 由图1可知，桦菌芝多糖对DPPH自由基具有较强的清除作用，当浓度为0.2～2.0 mg/mL时，DPPH自由基清除率随多糖浓度的增加而增强；当浓度为1.2 mg/mL时，桦菌芝多糖对DPPH 自由基的清除率(76%)高于对照品BHT(74%)，但低于对照品VC(79%)；当浓度为1.4 mg/mL时，桦菌芝多糖对DPPH自由基的清除率(82%)均高于对照品BHT(76%)和VC(81%)；当浓度为1.2～2.0 mg/mL时，桦菌芝多糖对DPPH自由基的清除率均高于对照品BHT及VC，表明桦菌芝多糖的抗氧化效果较好，可以作为植物抗氧剂使用。

图1 桦菌芝多糖对DPPH自由基清除率的影响

2.1.2 清除ABTS自由基的能力 由图2可知，当浓度为0.2～2.0 mg/mL时，桦菌芝多糖对ABTS自由基的清除能力与溶液浓度呈正相关。当供试品浓度为1.0 mg/mL时，桦菌芝多糖对ABTS自由基的清除率(70%)高于对照品BHT(69%)，且清除率随多糖浓度的增大而显著增强(P<0.05)；相同浓度下桦菌芝多糖与对照品BHT、VC间具有显著性差异(P<0.05)，说明一定浓度范围内的桦菌芝多糖对ABTS自由基有很好的清除作用。

图2 桦菌芝多糖对ABTS自由基清除率的影响

综上，桦菌芝多糖对DPPH自由基和ABTS自由基有很好的清除作用，可以直接作用于自由基或间接消耗掉容易生产自由基的物质，抑制氧化反应的发生[17]，起到抗氧化的作用。

2.2 桦菌芝多糖的抑菌能力

2.2.1 对细菌的抑制效果 由表1可知，桦菌芝多糖对大肠杆菌、金黄葡萄球菌、枯草杆菌、四联球菌具有不同程度的抑制作用，其抑菌效果与对照品青霉素钠之间无显著性差异(P>0.05)，但4种指示菌间的抑菌作用具有显著性差异(P<0.05)。其中，桦菌芝多糖对大肠杆菌的抑制作用最强，抑菌直径为(12.24±2.16) mm，接近阳性对照青霉素钠的[(12.36±1.86) mm]，对四联球菌的抑制较弱，抑菌直径为(3.54±0.76) mm。后续可通过大孔树脂色谱、凝胶过滤色谱、硅胶柱色谱等分离方法，筛选出抑菌活性成分。

表1 桦菌芝多糖对4种指示菌的抑制效果†

2.2.2 最小抑菌浓度(MIC) 由表2可知，桦菌芝多糖对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和四联球菌的MIC值分别为1.250，1.250，2.500，5.000 mg/mL，说明桦菌芝多糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌作用最强，对四联球菌的抑菌活性最弱；桦菌芝多糖的抑菌活性随浓度的增大而增强。后续可通过一定的分离纯化手段，得到准确的多糖MIC值。

表2 桦菌芝多糖的最小抑菌浓度†

3 结论

利用水提取乙醇沉淀法对桦菌芝多糖进行了提取及初步分离，研究了桦菌芝多糖的抗氧化和抑菌活性。结果表明，桦菌芝多糖对DPPH自由基和ABTS自由基均具有清除作用，且其清除能力与多糖浓度呈显著正相关，说明多糖是桦菌芝的主要抗氧化活性成分。体外抑菌试验显示，桦菌芝多糖对大肠杆菌、金黄葡萄球菌、枯草杆菌、四联球菌具有不同程度的抑制作用，其中对大肠杆菌的抑制作用最强。后续将对桦菌芝多糖进行进一步的分离纯化，以得到明确的抗氧化、抑菌活性成分，为桦菌芝多糖的深入研究利用，以及将其开发成为天然抗氧化剂和抑菌剂方面提供依据。