北沙参乙醇分级多糖的理化性质及抗氧化活性研究

景永帅 金 姗 张丹参 张瑞娟王非凡 郑玉光 吴兰芳

(1. 河北科技大学化学与制药工程学院，河北 石家庄 050018；2. 河北中医学院药学院，河北 石家庄 050200)

北沙参(GlehniaRadix)为伞形科植物珊瑚菜(GlehnialittoralisFr. Schmidt ex Miq.)的干燥根，是常用的补阴补气食材，具有养阴润肺功能[1]。它是卫生部公布的药食两用资源，主要分布在河北、山东和内蒙古等地。北沙参中含有挥发油类、香豆素类、多糖类和聚炔类等化学成分，其中多糖类含量最高，也是其主要活性成分之一，具有免疫调节、抗氧化和抗肿瘤等作用[2-3]。

乙醇分级沉淀法是制备多糖常用的提取纯化方法，它是将原料热水浸提后逐步提高乙醇的体积浓度来纯化多糖，多糖的得率和组成随着乙醇在醇沉时浓度的不同而变化[4]。此法优势在于成本低、耗时短，同时又能维持较高得率，且不同乙醇浓度沉淀得到的多糖具有不同的生物活性及应用价值[5]。实验室[2,6-7]前期优化了北沙参粗多糖的提取工艺，并发现北沙参多糖具有较好的清除自由基活性。

目前，关于北沙参乙醇分级纯化多糖的研究尚未见报道，为了寻找一种简单高效纯化北沙参多糖组分的方法，更好地探究成分与活性之间的关系。在前期研究[2,7]的基础上，试验拟以北沙参为研究对象，提取北沙参中多糖成分，并用终浓度为30%，50%，70%的乙醇对多糖进行分级纯化，制备得到4种不同组分的北沙参多糖，并测定4种组分多糖的可溶性总糖含量、蛋白含量、黏度、保水性、保油性、单糖组成、抗氧化活性等，以期为北沙参多糖的进一步开发和利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

北沙参：河北安国产，经河北中医学院药学院生药教研室郑玉光教授鉴定为伞形科珊瑚菜(GlehnialittoralisFr. Schmidt ex Miq.)的根；

3,5-二硝基水杨酸：分析纯，天津市光复精细化工研究所；

考马斯亮蓝：分析纯，合肥博美生物科技有限责任公司；

金龙鱼油：益海嘉里食品营销有限公司；

DPPH：分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

硫酸亚铁：分析纯，恒诚化工有限公司；

过氧化氢：分析纯，天津政成化学制品有限公司；

苯酚：分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；

其他试剂均为分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

紫外—可见分光光度计：UV-752型，上海光谱仪器有限公司；

傅里叶变换红外光谱仪：S-100型，珀金埃尔默仪器有限公司；

液相色谱仪：LC1220型，安捷伦科技(中国)有限公司；

液相色谱仪：e2695型，美国Alliance公司；

场发射扫描电镜：S-4800-1型，株式会社日立制作所；

差热—热重联用热分析仪：STD-2960型，美国TA仪器公司；

旋转黏度计：NDJ-1型，上海昌吉地质仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 北沙参各分级醇沉多糖制备 取粉碎后的北沙参于80 ℃水浴锅中，用3倍体积80%乙醇除脂2次，干燥备用。称取一定量除脂后的北沙参，用30倍体积蒸馏水回流加热提取2次，合并提取液，冷却抽滤，旋蒸至黏稠态，加无水乙醇使乙醇终浓度为30%，冷藏过夜，离心，将沉淀干燥得30%组分多糖GLP-30。离心后的液体旋蒸，回收乙醇至液体黏稠，再加入无水乙醇使乙醇终浓度为50%进行醇沉，冰箱过夜，离心后将沉淀干燥得50%组分多糖GLP-50。同样的操作步骤得GLP-70，对70%滤液进行旋蒸回收乙醇，装入透析袋(截留分子量为3 000 Da)，流水、蒸馏水依次透析24 h，蒸干得剩余组分多糖命名为GLP-剩余。

1.2.2 多糖可溶性总糖含量、蛋白质含量的测定

(1) 可溶性总糖含量：采用苯酚—硫酸法[8]。

(2) 蛋白含量：采用考马斯亮蓝法[9]。

1.2.3 黏度的测定 分别配制浓度为0.5，1.0 mg/mL的多糖粗品溶液各300 mL，室温条件下，旋转黏度计的剪切速率为60 s-1条件下，测定其表观黏度[10]。

1.2.4 保水性和保油性的测定 参照文献[11]。

1.2.5 紫外—可见光谱分析 取2.5 mg各多糖组分加适量蒸馏水溶解定容于25 mL容量瓶，在200～800 nm范围内用紫外—可见分光光度计扫描。

1.2.6 红外光谱扫描 取多糖样品与干燥的KBr粉末研磨均匀，压成薄片，在400～4 000 cm-1范围内进行红外光谱扫描。

1.2.7 微观形态测定 分别取4种多糖通过导电带吸附至样品台上，经喷金处理后，场发射扫描电镜进行分析，加速电压3.0 kV，分辨率7.2 mm，分别放大几个倍数，拍摄并记录各多糖的固体形貌。

1.2.8 差示扫描量热分析和热解重量分析 分别称取各多糖组分2.0 mg，升温速率10 ℃/min，升温至800 ℃，进行差示扫描量热分析(DSC)和热解重量分析(TGA)。以温度、失重率(某一温度下失重后样品的实测质量与样品总质量的比值)分别为X、Y轴，绘制热重变化曲线[10]。

1.2.9 单糖组成分析 选取8种单糖(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖)作为标准品。根据文献[12]略作修改，Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm250 mm，5 μm)；检测波长245 nm；柱温30 ℃；上样量20 μL；流速1 mL/min；流动相为磷酸盐缓冲液(0.1 mol/L，pH为6.85)—乙腈(83∶17，体积比)；洗脱方式为等度洗脱。

1.2.10 分子量的测定 采用凝胶渗透色谱(GPC)测定北沙参各多糖的分子量。分别称取5 mg标准葡聚糖T5 000、T50 000、T150 000、T270 000，加5.0 mL蒸馏水溶解，分别上G-100凝胶色谱柱。待样品渗下后，加入3倍体积蒸馏水渗下，关闭色谱柱下方管口，加满蒸馏水，装好柱头。打开恒流泵开始洗脱。设置自动部分收集器使每管收集10 mL。以有效分配系数Kav为纵坐标，lgM为横坐标作标准曲线，Kav根据式(1)计算：

(1)

式中：

Kav——有效分配系数；

Ve——待测样品的洗脱体积，mL；

V0——用蓝色葡聚糖确定凝胶柱的空体积，mL；

Vt——葡萄糖确定凝胶柱的总柱体积，mL。

配制5 mL浓度为1.0 mg/mL的多糖溶液，按上述方法加样，装柱头之前收集的体积记作前体积。收集完毕后测量各管体积，苯酚—硫酸法测定各管吸光度，检测样品出峰液分布情况，求出相应峰体积，计算出Kav。根据标准曲线方程计算出各多糖分子量及分布[13]。

1.2.11 DPPH自由基和羟基自由基清除能力的测定

参照文献[14]。

2 结果与分析

2.1 北沙参分级多糖的提取率、可溶性总糖含量、蛋白质含量和黏度

经乙醇分级得到4个北沙参多糖GLP-30、GLP-50、GLP-70和GLP-剩余，分别测定各组分多糖的得率、可溶性总糖含量、蛋白含量、黏度、保水保油性等，结果如表1所示。

由表1可知：

表1 北沙参各分级醇沉多糖的得率及理化性质

(1) 随着乙醇体积分数的逐渐增加，北沙参多糖的可溶性总糖含量降低，乙醇分级后的水提取中多糖为主要成分，含有少量蛋白质。GLP-30中可溶性总糖含量最高，蛋白质含量最少。

(2) 在多糖浓度相同时，分级多糖黏度大小为GLP-70>GLP-剩余>GLP-50>GLP-30。分级多糖的黏度具有浓度依赖性，随多糖浓度的增大，4种多糖的黏度均变大。多糖黏度受分子间的聚集、相对分子质量大小和成分组成相互作用影响[15]。

(3) 保水量大小为：GLP-30>GLP-70>GLP-50>GLP-剩余。保油量反映水胶体的功能特性，代表吸油能力。保油量大小为：GLP-50>GLP-70>GLP-30>GLP-剩余。多糖或蛋白质分子结构中含有许多亲水基团，如羟基、羧基、羧酸根等，这些基团水化后会形成黏稠胶体溶液，从而提高保水性和保油性。同时蛋白质分子间具有三维网状结构，通过大分子链上大量的亲油基团的作用，油分子被包裹在网络结构中，从而达到吸油保油的目的[16]。GLP-30具有较好的保水性，说明其结构中含有较多的亲水基团；GLP-50表现出较好的保油性，可能是由于其蛋白含量相对较高。

2.2 紫外—可见光谱分析

如图1所示，4个组分的紫外扫描图谱相似，均在280 nm 处有蛋白质的特征吸收峰[5]，且吸收峰的强弱顺序为GLP-剩余>GLP-50>GLP-70>GLP-30，表明这4种多糖均含有一定量的蛋白质，与考马斯亮蓝法测定蛋白含量结果基本一致。各样品在510 nm波长处均没有吸收，说明多糖中不存在黄酮类物质。

图1 北沙参各分级醇沉多糖的紫外—可见光谱图

2.3 红外光谱分析

由图2可知，各组分多糖红外光谱波峰趋势相似，在3 400 cm-1附近具有较宽的吸收峰，为O—H的伸缩振动。2 930 cm-1处较弱的吸收峰是由C—H的伸缩振动引起的，1 637 cm-1附近出现的可能是O—H的弯曲振动吸收峰、C—O吸收峰或糖醛酸的COO—非对称伸缩振动吸收峰，1 021 cm-1处为醚键的吸收峰，849 cm-1处为α-糖苷键的吸收峰[17]，均具有多糖的特征吸收峰。

图2 北沙参各分级醇沉多糖的红外光谱图

1 419 cm-1附近较小的吸收峰是N—H弯曲振动和C—N 伸缩振动的酰胺Ⅱ特征峰，表明分级多糖中有少量蛋白与糖结合[18]。GLP-30与其他3个组分在950～1 450 cm-1范围内的吸收峰有一定差别，提示GLP-30蛋白含量较低，与考马斯亮蓝法测定结果一致。

2.4 扫描电子显微镜分析

从图3可以观察到4个组分的固体形貌有一定差异性，GLP-30孔洞较大，表面高低不平有凸起堆叠。GLP-50孔洞较少，表面轻微凸起，较为光滑。GLP-70表面有大部分凸起，呈碎屑状堆积，颗粒较大，有较多孔洞，表面最为粗糙，可能与其黏度较大有一定关系。GLP-剩余表面光滑，质地紧致。

图3 北沙参各分级醇沉多糖的扫描电镜图

2.5 差示扫描量热—热重分析

根据差示扫描量热曲线(DSC)可以看出吸热峰和放热峰数量。根据热重曲线(TGA)可以了解北沙参多糖热裂解温度以及发生失重次数，在该区域温度，多糖发生了分解，化学键受到了破坏[19]。GLP-30、GLP-50、GLP-70、GLP-剩余的差示扫描量热—热重图谱如图4所示。由图4可知，当加热温度从40 ℃升温至400 ℃时，4个组分均首先出现一个吸热峰随后出现一个放热峰[20]。分析吸热峰的出现可能是由于多糖的吸水、熔化或者分解。随着温度的升高，多糖先发生失水过程，GLP-30、GLP-50、GLP-70、GLP-剩余分别于307.06，289.27，282.93，304.06 ℃ 发生分解，最后剩余的重量是灰分。4种组分的差示扫描量热结果相差较大，说明各组分多糖的糖链空间结构差别较大。

图4 北沙参各分级醇沉多糖的差示扫描量热—热重图

2.6 单糖组成

由图5和表2可知，4种组分多糖中GLP-30、GLP-50主要含有半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。GLP-70、GLP-剩余主要含有甘露糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖。试验结果与杜宝香等[21]和任浩娜[22]所得的结果类似，但未检测到葡萄糖醛酸和鼠李糖，可能是由北沙参的产地差异性和其含量较低导致。

1. Man甘露糖 2. Rha鼠李糖 3. GlcUA葡萄糖醛酸 4. GalUA半乳糖醛酸 5. Glc葡萄糖 6. Gal半乳糖 7. Xyl木糖 8. Ara阿拉伯糖

表2 北沙参各分级醇沉多糖的单糖组成和含量比

2.7 分子量

测得标准葡聚糖在试验浓度范围内，有效分配系数(Kav)与lgM呈良好的线性关系，回归方程为：y=0.409 4x+2.321 2，R2=0.998 77。

以峰值数据管数的总体积V为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制特征图谱，如图6所示。根据标准曲线方程，求得多糖样品分子量大小，如表3所示。分子量大小为：GLP-30>GLP-50>GLP-70>GLP-剩余，不同浓度的乙醇分级得到的北沙参多糖的分子量不同，随着乙醇浓度的增大分子量逐渐降低。李红法等[23]研究发现黄芪多糖分子量的变化，与试验结果一致，可能是由于乙醇体积分数的变化会影响沉淀中多糖的结构。

表3 北沙参各分级醇沉多糖分子量分布及其大小

图6 北沙参各分级醇沉多糖组分的凝胶渗透色谱图

2.8 抗氧化活性

2.8.1 清除DPPH自由基 由图7可知，随着糖浓度的增加，GLP-30、GLP-50、GLP-70和GLP-剩余对DPPH自由基的清除能力逐渐增强，呈浓度依赖性。半数清除率(IC50)值最小，说明其清除自由基能力最强。4种多糖及VC清除DPPH自由基能力的大小为：VC(0.005 mg/mL)>GLP-50 (0.123 mg/mL)>GLP-剩余 (0.299 mg/mL)>GLP-70 (0.364 mg/mL)>GLP-30 (1.822 mg/mL)，上述结果表明北沙参多糖具有较好的清除DPPH自由基的能力。

图7 北沙参各分级醇沉多糖对DPPH自由基清除作用

2.8.2 清除羟基自由基 如图8所示，4种多糖对羟基自由基清除能力均随浓度的增加而增大，并有良好线性关系。清除羟基自由基能力大小为VC(0.072 mg/mL)>GLP-50 (3.809 mg/mL)>GLP-30 (5.105 mg/mL)>GLP-70 (6.151 mg/mL)>GLP-剩余 (10.529 mg/mL)。4种多糖均低于阳性对照VC的IC50值。上述结果表明，北沙参多糖具有一定的羟基自由基清除能力，与周红英等[1]的研究一致。

图8 北沙参各分级醇沉多糖对羟基自由基清除作用

多糖抗氧化的构效关系会受到分子量、蛋白含量、糖醛酸含量、活性羟基数量、分子构象等方面的影响。王佳等[5]报道虎杖、麻黄和甘草多糖的抗氧化活性与糖醛酸含量呈正相关。许海棠等[24]报道山豆根多糖的抗氧化活性与其纯度，以及多酚和蛋白含量等有关。试验中GLP-50也表现出类似结果，因此分析半乳糖醛酸的含量较高是其抗氧化活性高的主要原因，同时也受蛋白含量影响。另外，GLP-50清除DPPH自由基的IC50值为0.123 mg/mL，对比实验室前期制备的北沙参粗多糖的清除DPPH自由基的IC50值(1.99 mg/mL)[7]，经乙醇分级沉淀后的多糖清除DPPH自由基效果明显提高。说明乙醇分级沉淀后的北沙参多糖在清除DPPH自由基功效方面具有良好利用价值。

3 结论

试验采用一种简单、高效的方法——乙醇分级沉淀法纯化北沙参多糖，得到GLP-30、GLP-50、GLP-70和GLP-剩余4个组分，经研究显示，不同浓度乙醇沉淀会影响北沙参多糖的得率、单糖组成、蛋白含量、分子量、黏度等理化性质，从而改变多糖的生物活性，各多糖组分分子量随乙醇浓度的增加而逐渐降低；GLP-50表现出最高得率和最好的抗氧化活性，其半乳糖醛酸含量最高并且含有较多的蛋白质。因此，推测半乳糖醛酸的含量较高是北沙参抗氧化活性高的主要原因，同时也受蛋白含量影响。综上，50%乙醇更适宜沉淀制备北沙参多糖，且所得多糖的抗氧化性比北沙参粗多糖的活性较强。后续研究可进一步深入解析北沙参多糖结构并探索其体内抗氧化活性功能，为北沙参多糖的构效关系研究和产品开发提供参考依据。