“凤丹”油用牡丹籽多酚提取工艺优化及抗氧化活性研究

蔡如玉 常世敏 宋春丽

(1. 河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056038；2. 河北农业大学食品科技学院，河北 保定 071001)

“凤丹”牡丹既是常见的药用品种，也是重要的油用品种[1]，在中国各地广泛种植。目前有关牡丹籽油提取工艺[2]、成分分析[3]、抗氧化活性分析[4]，牡丹籽黄酮提取工艺[5]等方面的研究较多，而关于牡丹籽多酚的提取工艺及其抗氧化活性尚未见报道。

多酚是高等植物中含有多元酚结构的次生代谢产物，广泛存在于植物根、皮、叶以及果实中[6]。研究[7-8]表明，多酚具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂、抗动脉硬化、抗衰老及预防心血管疾病等作用。王彦阳等[9]采用超声波辅助对腰果叶多酚进行了提取，其得率为10.29%；魏春红等[10]研究了酶法辅助提取小米多酚，最佳提取条件下总酚含量为4.83 mg/g；吕蒙蒙等[11]采用响应面法优化了超声波—微波协同萃取杉木球果鳞片多酚，其提取率相较于索氏提取法提高了76.58%，且缩短了提取时间；朱素英[12]、陈程等[13]分别采用超声波辅助对牡丹花和牡丹籽粕中多酚提取进行了研究，其提取率分别为130.627 mg/mL和17.42 mg/g。试验拟对牡丹籽多酚提取工艺进行优化，并采用体外抗氧化试验评价其抗氧化活性，为牡丹籽的综合利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

“凤丹”油用牡丹籽：河北国福牡丹科技开发有限公司；

没食子酸标品、Folin-Ciocalteu试剂：分析纯，北京索莱宝科技有限公司；

1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基：分析纯，梯希(上海)化成工业发展有限公司；

2,2- 联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐：分析纯，生工生物工程(上海)股份有限公司；

抗坏血酸、无水乙醇：分析纯，天津欧博凯化工有限公司；

过硫酸钾：分析纯，山东西亚化学股份有限公司；

无水碳酸钠：分析纯，天津市红岩化学试剂厂；

摇摆式高速中药粉碎机：F-1000型，1 000 g，新昌县德科机械有限公司；

高速台式离心机：TGL-10B型，上海安亭科学仪器厂；

高功率数控超声波清洗器：KQ-200KDB型，昆山市超声仪器有限公司；

恒温磁力搅拌器：85-2型，上海司乐仪器有限公司；

紫外—可见分光光度计：MAPADA型，上海美谱达仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 牡丹籽多酚提取 牡丹籽粉碎，过50目筛，称取5 g，按相应的液料比、乙醇浓度、提取温度、超声时间、超声功率进行多酚提取，5 000 r/min离心10 min， 收集上清液，冷藏备用。

1.2.2 标准曲线的绘制 参照文献[14]，得标准曲线回归方程为Y=7.298 8X+0.015 7，R2=0.997 7。

1.2.3 多酚含量的测定 采用福林酚试剂法[15]。按式(1) 计算多酚提取率。

(1)

式中：

R——多酚提取率，mg/g；

C——提取液多酚浓度，mg/mL；

V——提取液体积，mL；

m——样品质量，g。

1.2.4 单因素试验

(1) 料液比：精准称量5 g牡丹籽粉于锥形瓶，分别按料液比1∶10，1∶14，1∶18，1∶22，1∶26 (g/mL)加入60%乙醇，用磁力搅拌器搅拌30 min，于提取温度55 ℃、超声功率160 W下提取100 min，考察料液比对多酚提取率的影响。

(2) 超声时间：精准称量5 g牡丹籽粉于锥形瓶，按料液比1∶18 (g/mL)加入60%乙醇，用磁力搅拌器搅拌30 min，于提取温度55 ℃、超声功率160 W下分别提取60，80，100，120，140 min，考察超声时间对多酚提取率的影响。

(3) 提取温度：精准称量5 g牡丹籽粉于锥形瓶，按料液比1∶18 (g/mL)加入60%乙醇，用磁力搅拌器搅拌30 min，于提取温度分别为45，50，55，60，65 ℃，超声功率160 W下提取100 min，考察提取温度对多酚提取率的影响。

(4) 超声功率：精准称量5 g牡丹籽粉于锥形瓶，按料液比1∶18 (g/mL)加入60%乙醇，用磁力搅拌器搅拌30 min，于提取温度55 ℃、超声功率分别为120，140，160，180，200 W下提取100 min，考察超声功率对多酚提取率的影响。

1.2.5 响应面优化试验 在单因素试验的基础上，以料液比、超声时间、提取温度、超声功率为试验因素，以多酚提取得率为评价指标，设计四因素三水平响应面试验优化牡丹籽多酚提取工艺条件[16]。

1.2.6 体外抗氧化活性

(1) DPPH 自由基清除能力测定：参照文献[17]并略有改动，精确称取1.0 mg DPPH，加入20 mL无水乙醇，避光放置，3.5 h内用完。取2 mL DPPH溶液，加入1 mL 无水乙醇，混匀，室温避光反应30 min，测定517 nm处吸光度。以抗坏血酸为对照，每组重复3次，取平均值。按式(2)计算DPPH自由基清除率。

(2)

式中：

D——自由基清除率，%；

A0——反应体系吸光度；

A——样品吸光度；

(2) ABTS自由基清除能力测定：参照文献[18]并略有改动。精确称取3.0 mg ABTS，加入0.735 mL蒸馏水超声辅助溶解，配置7.4 mmol/L的ABTS 储备液。取1 mg 过硫酸钾，加入1.43 mL蒸馏水溶解，配置2.6 mmol/mL 的过硫酸钾储备液。ABTS储备液与过硫酸钾储备液按体积比1∶1混匀，室温避光反应12～16 h。用无水乙醇将ABTS母液稀释40～50倍，测定734 nm处测吸光度。取50 μL不同浓度样品液，加入ABTS母液950 μL，振动10 s，放置6 min， 测定734 nm处吸光值。以抗坏血酸为对照，每组重复3次，取平均值。按式(2)计算ABTS自由基清除率。

1.2.7 数据处理 单因素试验结果及体外抗氧化活性采用SPSS软件进行分析，响应面试验结果采用Design-Expert 8.0.6软件进行分析。每个试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对牡丹籽多酚提取率的影响 由图1可知，多酚提取率随料液比的不断增加而下降[19]。综合考虑，选取1∶18 (g/mL)为最佳料液比。

图1 料液比对多酚提取率的影响

2.1.2 提取温度对牡丹籽多酚提取率的影响 由图2可知，牡丹籽多酚提取率随提取温度的升高先上升后下降，当提取温度为55 ℃时，提取率最大，可能是提取温度过高导致热敏感的多酚类物质转化或降解，从而使提取率降低[17]。故选取55 ℃为最佳提取温度。

图2 提取温度对多酚提取率的影响

2.1.3 超声功率对牡丹籽多酚提取率的影响 由图3可知，多酚提取率随超声功率的升高先增加后下降，可能是功率过大加快了物料的温度与提取液的流动，在提高多酚浸出的同时也加快了多酚的分解和氧化。故选取160 W 为最佳超声功率。

图3 超声功率对多酚提取率的影响

2.1.4 超声时间对牡丹籽多酚提取率的影响 由图4可知，多酚提取率随提取时间的延长先增加后下降，可能是多酚随超声时间的延长发生氧化、缩合及分解等反应[20-21]。故选取100 min为最佳超声时间。

图4 超声时间对多酚提取率的影响

2.2 响应面优化试验

2.2.1 试验设计与分析 根据单因素试验结果，以料液比、提取温度、超声功率、超声时间为试验因素，以多酚提取率为响应值，根据Box-Behnken中心组合原理进行响应面设计，试验因素与水平表见表1，试验设计与结果见表2。

表1 响应面因素和水平设计表

表2 响应面试验设计与结果

2.2.2 模型的建立及方差分析 对表2结果进行统计分析[22]，建立牡丹籽多酚提取率的二次多项回归方程：

Y=33.28-0.066A+0.16B+0.038C-5.833D+0.038AB+0.083AC+0.013AD-0.047BC-0.023BD+0.033CD-0.090A2-0.19B2-0.082C2-0.13D2。

(3)

2.2.3 响应面分析 进一步对表3进行分析可知，料液比与超声功率的交互项对牡丹籽多酚提取的含量影响显著(P<0.05)[24]。由图5可知，在试验所选范围内，AC响应面较为陡峭，响应值存在极值，再次说明料液比与超声功率交互作用影响显著[25]。

图5 两因素交互作用对提取率的响应面图

表3 方差分析†

由响应面建立的模型及二次回归方程预测的最优提取工艺条件为料液比1∶13.74 (g/mL)、提取温度57 ℃、

超声功率159.16 W、超声时间98.44 min，此条件下多酚提取率为33.32 mg/g。为便于操作，将提取工艺条件修正为料液比1∶14 (g/mL)、提取温度57 ℃、超声功率160 W、超声时间98 min，进行3次实验验证，得到牡丹籽多酚提取率为33.38 mg/g，与预测值相近，说明该提取模型预测优化牡丹籽多酚提取工艺是准确可行的。

2.3 体外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 由图6可知，DPPH自由基清除能力随多酚粗提取液浓度的增加逐渐增强，当多酚粗提液浓度为100 μg/mL时，其清除能力达14.17%，低于维生素C的，表明多酚粗提液对DPPH自由基具有一定的清除能力。

图6 牡丹籽多酚对DPPH自由基的清除能力

2.3.2 ABTS自由基清除能力 由图7可知，ABTS自由基清除能力随多酚粗提取液浓度的增加而显著增强，当多酚粗提取液浓度为40 μg/mL时，其清除能力明显高于抗坏血酸的，表明多酚粗提液对ABTS自由基有较强的清除能力。

图7 牡丹籽多酚对ABTS自由基的清除能力

3 结论

试验表明，牡丹籽多酚的最佳提取工艺条件为料液比1∶13 (g/mL)、提取温度57 ℃、超声功率160 W、超声时间98 min，此条件下的提取率为33.38 mg/g。体外抗氧化试验发现，牡丹籽多酚粗提液对DPPH自由基和ABTS自由基均具有一定的清除能力，且呈良好的量效关系，表明牡丹籽多酚有可能成为一种新的天然抗氧化剂。后续可对“凤丹”牡丹籽多酚的代谢途径、单体种类及功能特性进行研究。