HPLC—ELSD法同时测定马铃薯中α－茄碱和α－卡茄碱含量

商婷婷 邝梦婷 胡新喜，2 熊兴耀，2 陆 英，3

（1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省马铃薯工程技术研究中心，湖南 长沙 410128；3.国家植物功能成分利用工程技术研究中心，湖南 长沙 410128）

马铃薯作为一种主要的经济作物在世界范围内广为种植。马铃薯植株和块根中含有一类甾体类糖苷生物碱，主要为α－茄碱和α－卡茄碱，在芽、幼叶、花、未成熟块根以及成熟薯皮组织中含量均较高［1］。研究表明，这类糖苷生物碱在体内外均具有较强的毒性［2，3］，有抗肿瘤［4］、抗疟［5，6］、强心［7］、抗病毒［8］、降脂［9］等多种功效，因此，在食品安全和医药开发中都具有重要意义。近年来的研究［10］还发现，这类生物碱对抵御病原菌和病虫害等有一定的作用，能抑制和杀灭某些真菌、细菌等病原微生物，因此，作为绿色农药的开发利用方面也具有广阔前景。

蒸发光散射检测器（ELSD）不依赖样品的光学性质，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，近年来被广泛用于低紫外吸收物质的检测，同时ELSD对物理性质相似的物质可以给出一致的响应和标准曲线［11，12］，可在无对照品的情况下，采用另外一种结构相似、含量已知的物质作对照，从而测定未知物的含量［13］。目前对马铃薯中生物碱含量的测定主要采用高效液相色谱法（HPLC）［14－18］，在210nm 处进行紫外检测（UV），由于分子内仅存在一个共轭双键，属于紫外末端吸收，溶剂对检测的影响较大，基线不稳，特别是当样品中生物碱含量低时，杂质干扰显得尤为严重。同时，α－卡茄碱标准品价格昂贵且难以获得，很多研究仅测定了α－茄碱的含量，缺乏对α－卡茄碱的研究报道。由于α－茄碱和α－卡茄碱具有相同的母核结构，分子结构极相似，本试验拟以α－茄碱为标准品，建立HPLC—ELSD同时检测马铃薯中两种主要生物碱的方法，并对马铃薯不同部位含量进行测定，为马铃薯中生物碱安全评价及开发利用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 试剂和材料

α－茄碱标样：纯度为99%，北京百灵威有限公司；

乙腈：色谱纯，美国天地公司；

马铃薯及茎叶材料：湖南农业大学湖南省马铃薯工程技术研究中心提供。马铃薯植株采于2014年5月中旬（品种：金湘），于地面上10cm处割下并分别制备茎、叶、叶柄、全株样品，马铃薯削皮约2～3mm厚，肉皮分离，所有鲜样切成小段或薄片，置60℃烘箱中干燥，粉碎，密闭后置冰箱备用。

1.2 仪器设备

高效液相色谱仪：LC－20A型，日本岛津公司；

ELSD检测器：ELSD－400型，美国SOFTA公司；

色谱柱：ZORBAX SB－C18（250mm×4.6mm，5μm），美国安捷伦公司；

旋转蒸发仪：RE－52AA型，上海亚荣生化仪器厂；

数显恒温水浴锅：HH型，金坛市金城国胜实验仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 HPLC—ELSD分析条件 流动相 A：0.1%三氟乙酸水溶液；B：乙腈；梯度洗脱：0～20min，25%～35%B；流速1mL/min，柱温35℃，ELSD雾化管温度30℃，漂移管温度98℃，载气压力6.90kPa。

1.3.2 α－茄碱标准曲线制作 精密称取α－茄碱标准品9.90mg用甲醇超声溶解定容至10mL，制成0.98mg/mL的标准溶液，取5，10μL进样，将该标准溶液用甲醇稀释10倍后再取2，5，10，20μL，每个进样体积重复进样3次，测定并记录峰面积，以进样质量（μg）的对数为横坐标（x），以化合物的平均峰面积的对数为纵坐标（y），绘制标准曲线，噪音3倍峰高质量为检出线。

1.3.3 α－卡茄碱定量方法 由于ELSD检测器对结构相似的物质具有相同的响应因子，因此具有相近的线性方程［11，12］，因此在无对标准品的情况下，可采用α－茄碱的标准曲线计算α－卡茄碱的含量。

1.3.4 样品含量测定 精确称取样品1.0g，用100mL 1%甲酸甲醇于70℃回流提取90min，过滤，薯皮、薯叶提取液定容至100mL，其他部位提取液在50℃下浓缩，定容至25mL，得供试品溶液。样液过膜，在1.3.1条件下进样，根据标准曲线计算α－茄碱和α－卡茄碱含量。

2 结果与分析

2.1 HPLC—ELSD分析条件的确定

文献［15～18］采用HPLC—UV法测定α－茄碱的流动相为H3PO4水溶液—乙腈，由于H3PO4不具挥发性，不能作为HPLC—ELSD的流动相，因此选用具有挥发性的三氟乙酸水溶液与乙腈为流动相，同时考虑到色谱柱的pH耐受值，确定水溶液中三氟乙酸的用量为0.1%。本试验首先考察并优化了漂移管温度、载气压力对色谱峰分离的影响，结果表明漂移管温度升高，流动相蒸发趋于完全，信号响应值变大，但温度过高，信号响应值变小，当漂移管温度为98℃时信号响应值最大；载气压力不同使载气流速不同，载气流速影响雾化器中液滴的形成，从而影响检测器的响应，载气压力为6.90kPa时，噪声信号小，色谱图基线平稳，目标组分响应值高。同时通过洗脱梯度的调整，在1.3.1色谱条件下两目标组分分离良好，根据标准物确定峰1为α－茄碱，根据文献［14］确定峰2为α－卡茄碱，见图1。

图1 α－茄碱及马铃薯皮提取液的HPLC—ELSD图谱Figure 1 HPLC—ELSD chromatogram ofα－solanine and the extract of potato skins

2.2 α－茄碱标准曲线绘制

按1.3.1方式进样，以标准品质量对数为横坐标x，峰面积对数为纵坐标y（图2）得回归方程为y＝1.207 9x＋4.807 0，r2＝0.999 5，α－茄碱在0.196～9.800μg线性关系良好。最低检出限为0.098μg。

图2 α－茄碱的标准曲线Figure 2 Standard curve ofα－solanine

2.3 马铃薯生物碱提取条件的确定

2.3.1 提取溶剂的选择 α－茄碱、α－卡茄碱属于甾体类生物碱，只溶于甲醇、乙醇、吡啶等少数有机溶剂中，同时它们具有弱碱性，能在酸性条件下成盐增加溶解度。文献［14～16］均采用酸提碱沉等方式提取及净化，本试验采用提取液直接进样，不需富集、净化等复杂前处理，并考虑ELSD检测器对进样溶液的要求，以马铃薯皮为原料，首先考察不同溶剂的提取效果，由表1可知，提取溶剂甲醇优于乙醇，甲酸优于乙酸，1%甲酸甲醇对α－茄碱、α－卡茄碱提取效果均最好。

表1 提取溶剂比较Table 1 Comparison of extraction solvent mg/g

2.3.2 提取条件的确定 以马铃薯皮为原料，1%甲酸甲醇为提取溶剂，在单因素试验的基础上，对提取温度、时间、溶剂用量进行三因素三水平的正交试验，因素水平表见表2，结果见表3。由表3可知：马铃薯生物碱最佳提取条件为A3B3C3。即提取温度70℃，提取时间90min，料液比1∶100（m∶V）。由极差分析可知：影响α－茄碱提取效果的因素依次为：时间＞温度＞溶剂用量，影响α－卡茄碱提取效果的因素依次为：溶剂用量＞温度＞时间，但均无显著性差异（方差分析表略）。验证实验（表4）表明，正交分析得到最佳提取条件A3B3C3优于正交组中含量最高组合A3B3C2。

表2 因素水平表Table 2 Factor level table

表3 正交试验结果与分析Table 3 Orthogonal experiment results

表4 提取条件的验证实验Table 4 Verification test of extraction conditions（n＝2）mg/g

2.4 精密度试验

取同一份样品溶液重复进样3次，记录α－茄碱、α－卡茄碱面积，结果见表5。由表5可知：同一样品重复进样，RSD分别为1.13%，0.58%，说明仪器精密度良好。

表5 精密度试验Table 5 Results of precision test

2.5 稳定性试验

取同一份样品溶液，分别于0，1，2，3，4h进样，记录α－茄碱、α－卡茄碱峰面积，结果见表6。由表6可知：样品溶液在4h内稳定，RSD 分别为2.33%，2.94%。

表6 稳定性试验Table 6 Results of stability test

2.6 重复性试验

取马铃薯皮样品，按方法分别制得供试品溶液3份，分别进样测定，记录α－茄碱、α－卡茄碱峰面积，结果见表7。由表7可知：峰面积RSD 分别为3.11%，1.10%，方法重现性好。

表7 重复性试验Table 7 Results of repeated test

2.7 加标回收试验

精密取已知含量的马铃薯皮原料3份各1.0g，精确加入α－茄碱标准品适量，按样品制备方法提取并分析，结果见表8。由表8可知：α－茄碱的回收率在101.61%～97.44%，平均回收率为99.4%，RSD为1.1%，回收率高，达到测定要求。

表8 加标回收率试验Table 8 Results of recovery test

2.8 样品含量测定

按1.3.4方法制备马铃薯不同部位供试品溶液，平行制备2次，测定结果见表9。由表9可知，马铃薯植物的不同部位均含有生物碱，且两种生物碱含量差异很大，α－茄碱的含量为0.13～1.59mg/g，由高到低为薯皮＞叶＞地上全株≈薯肉＞茎；α－卡茄碱的含量为0.39～8.28mg/g，由高到低为叶＞薯皮＞地上全株＞薯肉＞茎；两种生物碱总量为0.52～9.37mg/g，同一部位中α－卡茄碱的含量是α－茄碱含量的1.2～7.6倍。

3 结束语

本试验通过对提取条件的优化、检测方法学考察等试验建立了HPLC—ELSD测定马铃薯中两种主要生物碱α－茄碱和α－卡茄碱的方法，样品处理方法简便，不需净化直接进样，目标组分的色谱峰形好，柱效高，分离度好。同时试验基于ELSD检测器对结构相似物质具有相同响应因子的特点，通过α－茄碱的标准曲线完成α－茄碱和α－卡茄碱的含量测定，对一些标准品缺乏的物质含量检测具有一定的借鉴意义。

表9 马铃薯不同部位生物碱含量Table 9 Alkaloid content in different part of the potato plant（n＝2） mg/g

由试验结果可知，马铃薯植物的不同部位均含有生物碱，叶、薯皮、地上全株部分含量较高，特别是马铃薯地上部分的产量远大于马铃薯皮，因此以地上部分特别是叶作为原料进行糖苷生物碱的提取，并开发成为药品、生物农药等具有广阔的前景，也可为农业资源废弃物的深度开发利用开辟新的途径。

1 Mendel Friedman，Carol E Levin.α－Tomatine content in tomato and tomato products determined by hplc with pulsed amperometric detection［J］.J.Agric.Food Chem.，1995，43（6）：1 507～1 511.

2 Friedman M.Analysis of biologically active compounds in potatoes（Solanum tuberosum），tomatoes （Lycopersicon esculentum），and jimson weed（Datura stramonium）seeds［J］.J.Chromatogr A，2004，1 054（1～2）：143～155.

3 Mendel Friedman.Tomato glycoalkaloids：role in the plant and in the diet［J］.J.Agric.Food Chem.，2002，50（21）：5 751～5 780.

4 Y O Son，J Kim，J C Lim，et al.Ripe fruits of solanum nigrium L.inhibits cell growth and induces apoptosis MCF－7cells［J］.Food and Chemical Toxicology，2003，41（10）：1 421～1 428.

5 Rajananthanan P，Attard GS，Sheikh NA，et al.Novel aggregate structure adjuvants modulate lymphocyte proliferation and Th1 and Th2cytokine profiles in ovalbumin immunized mice［J］.Vaccine，1999，18（1～2）：140～152.

6 Heal KG，Sheikh NA，Hollingdale MR，et al.Potentiation by a novel alkaloid glycoside adjuvant of a protective cytotoxic T cell immune response specific for a preerythrocytic malaria vaccine candidate antigen［J］.Vaccine，2001，19（30）：4 153～4 161.

7 Bergers W W，Alink G M.Toxic effect of the glycoalkaloids solanine and tomatine on cultured neonatal rat heart cells［J］.Toxicol.Lett.，1980，6（1）：29～32.

8 Thome H V，Clarke G F，Skuce R.The inactivation of herpes simplex virus by some Solanaceae glycoalkaloids［J］.Antiviral Res.，1985，5（6）：335～343.

9 M Friedman，T E Fitch，W E Yokoyama.Lowering of plasma LDL cholesterol in hamsters by the tomato glycoalkaloid tomatine［J］.Food Chemical Toxicology，2000，38（7）：549～553.

10 Alison M Fewell，James G Roddick.Interactive antifungal activity of the glycoalkaloidsα－solanine andα－chaconine［J］.Phytochemistry，1993，33（2）：323～328.

11 王明娟，胡昌勤，金少鸿.氨基糖苷类抗生素在蒸发光散射检测器中响应因子的一致性考察［J］.药学学报，2002，37（3）：204～206.

12 洪建文，胡昌勤，盛龙生.喹诺酮类抗生素在蒸发光散射检测器中响 应 因 子 的 一 致 性 考 察 ［J］.药 学 学 报，2003，38（9）：695～697.

13 Fang L，Wan M，Pennacchio M，et al.Evaluation of evaporative light－scattering detector for combinatorial library quantitation by reversed phase HPLC［J］.J.Comb Chem.，2000，2（3）：254～257.

14 Robert J Houben，Kommer Brunt.Determination of glycoalkaloids in potato tubers by reversed high－performance liquid chromatography［J］.Journal of Chromatography A，1994，661（1～2）：169～174.

15 王守兰，朱佳.高效液相色谱法测定马铃薯中α－茄碱的含量［J］.食品科学，1996，17（6）：60～61.

16 肖文，李勤，熊兴耀，等.高效液相色谱法分析马铃薯中α－茄碱［J］.分析化学，2011，39（9）：1 459～1 460.

17 Lan Dao，Mendel Friedman.Comparison of glycoalkaloid content of fresh and freeze－dried potato leaves determined by HPLC and colormetry［J］.Agric.Food Chem.，1996（8）：2 287～2 291.

18 Sotelo A，Serrano B.High－performance liquid chromatographic determination of the glycoalkaloids alpha－solanine and alphachaconine in 12commercial varieties of Mexican potato［J］.Agric.Food Chem.，2000，48（6）：2 472～2 475.