低场核磁共振研究热烫对纤丝干酪水分状态的影响

苗 颖 赵 征

（1.天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457；2.天津农学院食品科学系，天津 300384）

Mozzarella干酪是意大利Pasta Filata（帕斯特－费拉特）干酪中的一种［1］。在Mozzarella干酪制作过程中，在热水中揉捏处理干酪凝块时，可赋予成品干酪特有的纤维结构、融化性和拉伸性，因此Mozzarella干酪在整个干酪加工中占有重要地位［2，3］。纤丝干酪（string cheese）是Mozzarella类干酪的一种直接食用的产品，由于纤丝干酪进行热烫拉伸处理时热烫温度高于其它Mozzarella类干酪，因此其成熟时间短，制作周期短，同时可以用手撕下干酪的纤维，口味柔和清谈，采用真空包装，保质期长，作为休闲食品直接食用，具有较高的附加值。水分子的状态和水分子的流动性情况对纤丝干酪的功能特性有显著影响，因此研究热烫温度对纤丝干酪水分状态的影响对纤丝干酪的生产具有重要意义。

Mozzarella干酪特有的热烫拉伸过程使其微观结构不同于其它种类干酪。Oberg等［4］通过电子显微镜观察到热烫拉伸过程赋予Mozzarella干酪平行方向的蛋白纤维网络结构，同时在蛋白纤维束空隙间存在水和脂肪球，蛋白纤维束空隙间自由水的聚集对干酪的持水力是不利的。Guo等［5］观察到在Mozzarella干酪制作完成的初期，干酪会渗出水分，在新切割的干酪表面，水分渗出现象会更加明显。近年来，低场核磁共振技术（low field－NMR）广泛应用于生物体系中结合水的研究。它可以测定能反映水分子流动性的氢核的纵向弛豫时间和横向弛豫时间，分别称为自旋－晶格弛豫（T1）和自旋－自旋弛豫（T2）。各个系统内水分含量和分布不同都会造成T1和T2弛豫时间的快慢变化［6，7］。T2弛豫时间比T1弛豫时间对水分分布状态更加敏感。通过分析T2弛豫时间的不同，较容易区分出易流动损失的水分和通过物理、化学作用紧密结合的水分［8］。Aylin Altan等［9］利用低场核磁共振仪研究了Feta干酪盐浴期间水分状态变化。Raffaella Gianferri等［10］购买了5种品牌由水牛乳制作的Mozzarella干酪，利用低场核磁共振仪对5种Mozzarella干酪的16d成熟期内的水分状态进行了比较。至今为止尚无热烫温度对纤丝干酪水分状态影响的研究。本试验利用低场核磁共振技术研究热烫温度对纤丝干酪水分状态的影响，旨在揭示纤丝干酪贮藏过程中水分状态的变化规律，为纤丝干酪的生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 原料

原料乳：每100mL原料乳中蛋白质质量为3.17g、脂肪质量为3.52g、水分为87.76g，原料乳pH 值为6.75，购自塘沽奶牛养殖场；

TCC－3直投式菌种：丹麦科汉森有限公司；

Stamix1150凝乳酶：含质量分数50%牛胃蛋白酶和质量分数50%小牛皱胃酶，酶活力1 070U／g，丹麦科汉森有限公司。

1.2 主要仪器和设备

电子天平：JT201N 型，上海精天电子仪器有限公司；

酸度计：FE20型，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；

多功能气调封口机：DZ400－JO 型，温州中聊包装机械有限公司；

台式高速平衡离心机：L420型，北京雷勃尔离心机有限公司；

核磁共振分析仪：NMI20 型，上海纽迈电子科技有限公司；

单螺旋干酪拉伸机：TUST800 型，Φ57 mm×300 mm，天津科技大学自制。

1.3 试验方法

1.3.1 纤丝干酪工艺流程

新鲜牛乳→过滤→巴氏杀菌→冷却→加发酵剂、CaCl2→凝乳酶凝乳→切割→加热收缩→排乳清→堆酿→加盐→热烫、拉伸→成型→冷却→包装→成品［11］

1.3.2 纤丝干酪可榨乳清质量分数的测定 不同热烫温度样品在0～4 ℃温度下保存，分别在贮存的第1、4、7、10天测定其可榨乳清质量分数。可榨乳清质量分数测定方法：称取15g左右样品于离心管中，在25℃（室温）12 500r／min条件下离心60min，弃去上清液并用滤纸吸干离心管壁残留的水分，最后计算可榨乳清占15g样品量的百分比，即代表干酪持水力［12］。可榨乳清质量分数越低，表明干酪的持水力越高。

式中：

R—— 可榨乳清质量分数，%；

m1—— 离心前样品质量，g；

m2—— 离心后样品质量，g。

1.3.3 自旋－自旋弛豫特性分析 干酪样品在0～4 ℃温度下保存，分别在贮存的第1、4、7、10天测定样品的自旋－自旋弛豫时间T2（ms）。样品直径10mm，高度约为15mm，装于15mm 外径的试管底部，置于磁场中心位置的射频线圈的中心，利用硬脉冲自由感应衰减信号（free induced decay，FID）调节共振中心频率，然后进行多脉冲回波序列（carr－purcell－meiboom－gill，CPMG）扫描试验，轮流采样，每个样品测试3遍［13］。仪器参数：90°脉宽为9.5μs；180°脉宽为19μs；采样点数为375 146；采样谱宽为250kHz；重复时间为1 500ms；累计扫描4次；回波时间100μs；回波个数为7 500。

低场核磁弛豫测量得到的图为多指数衰减曲线，其数学模型为：

式中：

A（t）—— 衰减到时间t时的幅值大小；

t—— 衰减时间，ms；

A0i—— 第i个组分平衡时的幅值大小；

T2i—— 第i个组分的自旋－自旋弛豫时间，ms。

CPMG 指数衰减曲线用仪器自带的 MultiExp InvAnalysis软件进行反演，得到T2值。该软件使用整体迭代修正的NMR 弛豫信号多指数反演算法，结果为离散型与连续型相结合的T2谱。为了分析方便，采用弛豫图每个组分峰值对应的时间作为T2，而弛豫峰的宽度为基线上峰底的宽度［14］。

1.4 数据处理

试验数据用STATISTIX 8.1软件进行处理，试验数据采用完全随机设计方差分析，均数之间采用LSD 多重比较进行差异显著性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 热烫温度对纤丝干酪可榨乳清质量分数的影响

纤丝干酪经过热烫拉伸过程后会形成平行方向的副酪蛋白纤维网络结构，同时在副酪蛋白纤维束空隙间存在着水和脂肪球，可榨乳清即为位于副酪蛋白纤维束空隙间的水分，它的聚集对干酪的持水力不利［4］，可榨乳清质量分数降低表明干酪的持水力升高。不同热烫温度制作的纤丝干酪可榨乳清质量分数随贮藏时间的变化见图1。由图1 可知，随着干酪贮藏时间的延长可榨乳清质量分数呈下降趋势，表明干酪在成熟过程中持水力升高。这是由于在干酪成熟过程中副酪蛋白纤维网络吸水膨胀，体积扩大，侵占了脂肪球与可榨乳清原来存在的空间，致使原来部分蛋白之间的相互作用被蛋白与乳清水分子之间相互作用取代，蛋白水合区域增加，水合作用增强。由于蛋白质的水合区域增加，副酪蛋白纤维网络可以容纳更多的额外的水分子，引起可榨乳清质量分数下降，干酪持水力增强［9，10］。

由图1还可以看出，在纤丝干酪制作1d后可榨乳清质量分数大小为75 ℃样品＞85 ℃样品＞95 ℃样品，即干酪持水力大小依次为95 ℃样品＞85 ℃样品＞75 ℃样品，在纤丝干酪贮藏10d后可榨乳清质量分数大小依次为95℃样品＞85 ℃样品＞75 ℃样品，即干酪持水力大小依次为75 ℃样品＞85 ℃样品＞95 ℃样品，说明随着贮藏时间的延长，热烫温度低的样品，干酪的持水力较好。这是由于热烫拉伸过程引起干酪中凝乳酶和乳酸菌蛋白酶的失活，热烫温度越高凝乳酶和乳酸菌蛋白酶失活越严重，进而影响蛋白水解程度，导致蛋白水合区域面积下降造成的。

图1 不同热烫温度的纤丝干酪可榨乳清质量分数随贮藏时间的变化Figure 1 Changes in expressible serum in string cheese with three different stretching temperature under different storage

2.2 热烫温度对纤丝干酪水分状态的影响

CPMG 指数衰减曲线拟合得到2 个组分的数据，即T21、T22。表1为不同热烫温度的纤丝干酪T21和T22随贮藏时间的变化。T21弛豫时间变化范围为5～17ms，代表与干酪中的蛋白质结合紧密的结合水；T22弛豫时间变化范围为35～65 ms，代表与干酪中的蛋白质结合松散的自由水［15，16］。自旋－自旋弛豫时间T2反映了样品内部氢质子所处的化学环境，与氢质子所受的束缚力及其自由度有关，而氢质子的束缚程度又与样品的内部结构有密不可分的关系，氢质子受束缚越大或自由度越小，T2弛豫时间越短；反之则T2弛豫时间越长，因此T21代表的结合水比T22代表自由水受束缚程度高，即自由度小。由于干酪中的另一主要组成物质脂肪是疏水的，因此纤丝干酪中的水分子一定受干酪中蛋白质束缚程度不同，或者与蛋白质紧密结合或者远离蛋白质。

由表1可知，不同热烫温度制作的纤丝干酪样品T21、T22随着贮藏时间的延长均呈上升趋势，在干酪成熟10d后，75 ℃样品T21上升了173.8%，T22上升了49.0%；85 ℃样品T21上升了133.3%，T22上升了40.7%；95 ℃样品T21上升了102.8%，T22上升了30.4%，说明不同热烫温度制作的纤丝干酪内部的结合水和自由水随着贮藏时间延长自由度均增大，且自由度增加幅度大小依次为75 ℃样品＞85 ℃样品＞95 ℃样品，即热烫温度越低自由度增幅越大。揭示了纤丝干酪中的蛋白质在拉伸成型后并不是静态的而是进行了结构重排［17］，副酪蛋白纤维网络内蛋白质的水解和酪蛋白的脱盐作用引起蛋白质结构变化和蛋白质的水合区域增加［18］，因此引起结合水和自由水受束缚程度减少，自由度增大；同时热烫温度对纤丝干酪的成熟过程影响很大，热烫温度越高，干酪中酶失活越严重，蛋白质水解过程越温和，水合区域增加缓慢，结合水和自由水自由度上升较慢。不同大写字母表示同行数值有显著性差异（P＜0.05），不同小写字母表示同列数值有显著性差异（P＜0.05）。

表1 不同热烫温度的纤丝干酪T21和T22随贮藏时间的变化Table 1 Changes in T21and T22of string cheese with different stretching temperature under different storage

由表1还可以看出，不同热烫温度的纤丝干酪在贮藏10d过程中T21差异显著；T22在贮藏7d前差异不显著，贮藏10d后差异显著，说明干酪在贮藏过程中热烫温度对结合水的影响程度高于自由水。这是因为热烫温度主要影响蛋白水解程度，揭示了结合水自由度的增加是由于蛋白水解引起的，自由水自由度的增加可能是由副酪蛋白纤维网络挤占脂肪球和乳浆水空间，蛋白与乳清水接触面积增加，水合作用增强引起的。

不同热烫温度的纤丝干酪质子强度A1和A2随贮藏时间的变化见表2。质子强度A1和A2是表示样品中弛豫时间分别在T21和T22范围内的状态水含水率的相对尺度。由表2可知，随着贮藏时间的增加质子强度A1呈上升趋势，质子强度A2呈下降趋势，在纤丝干酪成熟10d后75 ℃样品A1上升206.2%，A2下降38.1%；85 ℃样品A1上升153.6%，A2下降32.3%；95℃样品A1上升135.9%，A2下降30.1%，即水分迁移量大小依次为75 ℃样品＞85 ℃样品＞95 ℃样品。说明纤丝干酪在贮藏过程中水分发生了迁移，从相对自由态向结合态的迁移过程，热烫温度越低水分迁移量越大。干酪在贮藏过程中蛋白质水解以及蛋白与脂肪浆液中的水分子水合作用增加，致使副酪蛋白纤维网络可以容纳更多的水分子，同时在脂肪浆液一侧的化学势比副酪蛋白纤维网络一侧化学势高，膜两边化学势的不平等引起的渗透作用是干酪内相对自由的水分向副酪蛋白纤维网络内转移的推动力，水分在纤丝干酪贮藏期间才可以迁移到副酪蛋白纤维网络内，成为副酪蛋白纤维网络的一部分［19］。热烫温度越高，蛋白质水解程度越低，水合区域面积下降，水合作用减弱，水分迁移量越低。

表2 不同热烫温度的纤丝干酪质子强度A1 和A2 随贮藏时间的变化Table 2 Changes in A1and A2of string cheese with different stretching temperature under different storage

3 结束语

当热烫温度在75，85，95 ℃变化时能够影响纤丝干酪贮藏过程中蛋白质水解程度以及蛋白质水合区域面积变化，因此纤丝干酪的持水力以及水分子的自由度和迁移量随着热烫温度不同呈现不同特征。试验结果表明，随着贮藏期延长低热烫温度（75 ℃）的纤丝干酪的持水力高。利用低场核磁共振仪对纤丝干酪的自旋－自旋弛豫时间T2的测定，纤丝干酪中的水分分成两部分，即结合水（T21）和自由水（T22），在干酪贮藏10d过程中结合水和自由水自由度增大，且自由度增加幅度大小依次为75 ℃样品＞85 ℃样品＞95 ℃样品，同时纤丝干酪在贮藏过程中水分发生迁移，从相对自由态向结合态的迁移过程，水分迁移量大小依次为75 ℃样品＞85 ℃样品＞95 ℃样品。

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