大孔吸附树脂对玉米蛋白水解液脱盐效果的研究

孙 旭 肖志刚 马秀婷 李 良

（东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

玉米蛋白粉（corn gluten meal，CGM）是湿法生产玉米淀粉时主要副产物，其蛋白质含量达60%以上，主要成分为醇溶蛋白（68%）、谷蛋白（22%）、球蛋白（1.2%）和白蛋白［1］。由玉米蛋白酶解生成的玉米肽具有水溶性好、溶解度不受pH 影 响、高浓度低黏度［2］等特点，并具有抗氧化［3，4］、降血压［5］、抗疲劳［6，7］、促进乙醇代谢［8，9］等生理活性。但在酶解过程中，为了维持反应体系pH 的恒定，需要不断加入碱溶液，导致体系中存在大量的无机盐。这些无机盐不仅影响玉米肽的口感，对理化性质的测定及生理活性的研究都有一定的负作用；此外，在蛋白水解液中还含有未完全水解的蛋白质、酶及有机胶体等杂质［10］，这些会限制其在食品领域的应用。因此，需要对玉米蛋白水解液进行脱盐，精制玉米肽。

目前，生物活性物质较常用的脱盐方法有离子交换树脂法和大孔吸附树脂法。大孔吸附树脂的分离机理是吸附原理和分子筛原理，主要是通过分子间疏水相互作用对分子进行吸附，因此大孔吸附树脂不仅可以脱盐还可以保留水解物中的疏水性肽段。大孔吸附树脂是由苯乙烯、二乙烯苯、二甲丙烯酸酯等聚合而成的网状孔穴结构，为非离子的高分子吸附剂，具有成本低、选择性好、吸附容量大、回收率高、容易再生等特点［11，12］。

本试验选用大孔吸附树脂DA201－C 为吸附剂，对玉米蛋白水解液进行脱盐试验，确定最佳解吸剂，并进一步研究pH 值、样品浓度及上样速度对玉米多肽回收率的影响，为玉米多肽的后续分离、纯化提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米蛋白粉：长春大成玉米开发有限公司；

2709碱性蛋白酶：88 244 U／g，枣庄市杰诺生物酶有限公司；

大孔吸附树脂层析柱：Φ2.6cm×30cm，上海华美实验仪器厂；

DA201－C 大孔吸附树脂：江苏苏青水处理工程集团有限公司；

其它试剂：分析纯，市售。

1.2 仪器与设备

食品蒸煮挤压机：DS56－Ⅲ型，济南赛信膨化机械有限公司；

振荡培养箱：BS－2E型，金坛市国旺实验仪器厂；

超微量分光光度计：K5600 型，北京凯奥科技发展有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 玉米多肽的制备 将一定条件下挤压膨化出的玉米蛋白粉烘干、粉碎、过筛，按料液比1∶10（m∶V）加水调制，置于三角瓶中，在酶与底物比10%，pH 为9.5，温度为55 ℃条件下酶解4h，95 ℃灭酶15min，反复离心（10 000r／min，20min）3次，合并上清液，上清液即为玉米多肽溶液。

1.3.2 大孔吸附树脂的预处理 用无水乙醇浸泡树脂24h，使其充分溶胀，然后用无水乙醇洗至流出液加水不呈白色浑浊为止，而后用去离子水充分洗净乙醇。然后用5%HCl溶液浸泡树脂3h，而后用去离子水洗至水洗液呈中性，最后用2% NaOH 溶液浸泡树脂3h，再用去离子水洗至水洗液呈中性备用。

1.3.3 大孔吸附树脂对玉米多肽的静态吸附及解吸 将15mL树脂加入到250 mL 的具塞锥形瓶中，向其中加入浓度为30mg／mL的玉米蛋白水解液15mL，将锥形瓶置于摇床中（转速为160r／min），室温振荡12h，至吸附平衡，每隔30min取样进行分析。选择水和不同浓度的乙醇（35%，55%，75%，95%）作为洗脱剂，对已达到吸附饱和的树脂进行24h解吸。

1.3.4 大孔吸附树脂对玉米多肽的动态吸附及解吸 采用2.6cm×30cm 规格的层析柱，将DA201－C大孔吸附树脂装入层析柱中。在室温条件下，将玉米多肽溶液以一定的浓度、pH、速度流进层析柱，用紫外检测器检测流出液的A220nm。先用去离子水洗涤层析柱，洗脱液每8 mL 收集1管，取每管中1mL稀释50倍，测定其电导率，直至洗脱液的电导率与去离子水相当，用75%浓度的乙醇进行洗脱，收集洗脱峰，冷冻干燥。

1.3.5 工艺条件的确定

（1）酶解液pH 对多肽回收率的影响：在室温条件下，将肽 浓度 为30 mg／mL 的 酶 解 液pH 值 分 别 调 为7，8，9 以2BV／h的流速上样，用去离子水洗涤层析柱，直至洗脱液的电导率与去离子水相当，用75%浓度的乙醇进行洗脱，以多肽的回收率为指标，确定最佳酶解液pH。

（2）酶解液浓度对多肽回收率的影响：在室温条件下，将肽溶液（pH＝8）分别配置成15，30，45mg／mL 以2BV／h的流速上样，用去离子水洗涤层析柱，直至洗脱液的电导率与去离子水相当，用75%浓度的乙醇进行洗脱，以多肽的回收率为指标，确定最佳酶解液浓度。

（3）酶解液流速对多肽回收率的影响：在室温条件下，将肽浓度为30mg／mL的酶解液（pH＝8）分别以1.0，1.5，2.0BV／h的流速上样，用去离子水洗涤层析柱，直至洗脱液的电导率与去离子水相当，用75%浓度的乙醇进行洗脱，以多肽的回收率为指标，确定最佳酶解液流速。

1.3.6 测定项目及方法

（1）肽含量的测定：Folin－酚法。

（2）灰分含量的测定：马弗炉灰化法（GB／T 5009.4——2010）。

（3）相关指标的测定：按式（1）～（5）计算。

2 结果与讨论

2.1 大孔吸附树脂对玉米多肽的静态吸附及解吸

2.1.1 大孔吸附树脂对玉米多肽的静态吸附能力 DA201－C大孔吸附树脂对玉米多肽的静态吸附率和吸附量随时间的变化规律见图1。

图1 大孔吸附树脂对玉米多肽的吸附曲线Figure 1 Static adsorption curves of MAR DA201－C to corn peptides

由图1可知，大孔吸附树脂对玉米多肽的静态吸附过程中，在最初的2h内，吸附率和吸附量随时间的增加而不断增加，尤其在前0.5h增加非常迅速，而2h后吸附率和吸附量随时间的增加无明显变化，说明2h左右时已到达树脂吸附的饱和，吸附平衡时的吸附率为92.32%，吸附量为27.7mg／mL，说明对玉米多肽DA201－C 大孔吸附树脂表现出良好的吸附性能。

2.1.2 大孔吸附树脂对玉米多肽的静态解吸 由表1 可知，在所选的解吸剂中，水的解析率最低，乙醇溶液的解析率随乙醇含量的增加而增大，75%乙醇的解析率最高。无水乙醇的解析率比75%乙醇的解析率低，这可能是因为玉米多肽在无水乙醇中溶解程度有限［13］，致使解析率下降，所以选用75%乙醇为解吸剂。

表1 不同浓度的乙醇溶液对玉米多肽的静态解吸效果Table 1 Effect of ethanol concentration on static desorption of the resin

2.2 大孔吸附树脂对玉米多肽的动态吸附及解吸

大孔吸附树脂对玉米多肽动态吸附过程的电导率和A220nm随洗脱体积的变化曲线见图2。由图2可知，用去离子水洗涤层析柱时，洗脱液的电导率先升高后降低，出现一个洗脱峰后，电导率变化逐渐平缓，说明层析柱中的无机盐离子基本被洗出。随后，用75%乙醇洗脱层析柱，洗脱曲线的拖尾现象可能是由于玉米多肽溶液中大分子组分在75%乙醇溶液中溶解性不佳，无法完全洗脱所致。

图2 大孔吸附树脂对玉米多肽吸附和脱盐效果Figure 2 Dynamic adsorption and desalination of MAR DA201－C to corn peptides

2.3 工艺条件的确定

通过研究玉米蛋白酶解液pH 值、多肽浓度、上样速度对流经大孔吸附树脂DA201－C 溶液的多肽回收率的影响，确定最佳工艺条件，结果见图3～5。

由图3可知，当pH 为8 时，玉米多肽回收率最高，当pH 为7或9时，玉米多肽回收率略有下降，可能是在此pH条件下，大孔吸附树脂对玉米多肽的吸附能力降低。因此确定最佳pH 为8。

图3 pH 对玉米多肽回收率的影响Figure 3 Effects of pH value on recovery of corn peptides

图4 样品浓度对玉米多肽回收率的影响Figure 4 Effects of concentration of corn peptides on recovery

图5 样品流速对玉米多肽回收率的影响Figure 5 Effects of flow rate on recovery of corn peptides

由图4可知，随着样品浓度的增加，玉米多肽回收率呈下降趋势。这是因为样品浓度较低时，玉米肽能够与树脂充分接触，在疏水相互作用条件下，能更有效地被树脂吸附。但随样品浓度的降低，试验周期就会延长，虽然30 mg／mL比15mg／mL的样品肽回收率低，但可以缩短一半周期，当样品浓度为45mg／mL 时，肽损失较多。综合考虑后，定最佳样品浓度为30mg／mL。

由图5可知，样品流速对肽回收率也有一定影响。当样品流速为1BV／h时，肽回收率较高，随着样品流速的增加，肽回收率下降，但相差不大。综合考虑后，确定最佳样品流速为2BV／h。

根据上述结果，确定玉米多肽脱盐工艺的条件为样品pH 为8，浓度为30mg／mL，样品流速为2BV／h。

2.4 脱盐效果分析

在最佳工艺条件下对玉米多肽溶液进行脱盐，对脱盐前后玉米多肽的分析结果见表2。

由表2可知，大孔吸附树脂脱盐后玉米多肽中蛋白质含量明显增加，灰分含量大大降低，脱盐率达90%以上，脱盐效果良好。因此，采用DA201－C 大孔吸附树脂可以有效的去除玉米蛋白酶解液中的无机盐。

表2 脱盐前后玉米多肽的成分对比Table 2 Composition of corn peptides before and after desalting

3 结论

采用大孔吸附树脂DA201－C对玉米蛋白水解液进行脱盐处理是一种简便有效的方法。较佳的工艺条件为样品pH 8，多 肽 浓 度30 mg／mL，上 样 速 度2 BV／h，洗 脱 剂 为75%乙醇。在此条件下，玉米多肽回收率为79.67%，脱盐率达90.10%。目前对大孔吸附树脂应用和性能研究已经相当广泛，虽然存在一些不足，如缺乏药用标准，在应用中缺乏规范化的技术要求等，但与其它常规脱盐方法相比，大孔吸附树脂法优点在于费用低、操作简单、条件温和，可以避免加热、化学处理等过程造成有效成分活性的降低。另外，作为洗脱剂的乙醇解吸性能较佳，具有沸点低，利于回收利用的特点。本试验为玉米多肽的进一步富集纯化研究奠定基础，在后续试验中可对玉米多肽的分子量以及生理活性展开研究。

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