鲢鱼糜漂洗液中蛋白质分析与回收

许艳顺 高 琪 姜启兴 夏文水

（江南大学食品学院，江苏 无锡 214122）

在鱼制品加工中，鱼糜制品因其高蛋白、低脂肪、口感嫩爽等特点已成为深受国内外消费者欢迎的水产加工大类产品，在中国已形成一定的产业化规模，并且发展迅速，产量和消费量逐年增加。在鱼糜生产过程中，鱼肉必须经过多次漂洗以除去部分阻碍鱼糜凝胶形成和影响鱼糜感官品质的酶类、脂肪、色素、无机盐等杂质，同时引起大量蛋白质主要是水溶性蛋白质的损失，导致鱼糜得率降低［1］。漂洗废水中一般含有0.5%～2.3%的蛋白质，直接排放不仅污染环境，同时还造成蛋白质资源的浪费［2］。因此，对鱼糜漂洗废水中蛋白质进行回收利用，可以降低鱼糜漂洗废水对环境的污染，同时可以提高资源利用率和企业经济效益。

近年来，对鱼糜漂洗废水中蛋白质的回收利用已引起国内外研究者的广泛关注。目前鱼糜漂洗废水中蛋白回收方法主要有膜分离法［3］、絮凝法［4，5］、调节pH 值法［1，6］、电阻加热法［7］等。膜分离法回收效果较好，但易导致膜污染；电阻加热法耗能大，回收成本较高［8］。褐藻胶作为天然有机高分子絮凝剂对废水中蛋白质具有较好的絮凝效果，且回收蛋白可回添至鱼糜中［9，10］。蛋白质是带有正电荷和负电荷基团的两性电解质，利用蛋白质在等电点附近较低的溶解性来沉淀回收漂洗液中蛋白质，操作简单，成本低廉［1］。

本试验对鲢鱼糜不同漂洗阶段的漂洗液中蛋白含量和组成进行分析，并进一步采用调节鱼糜漂洗液pH 法和海藻胶絮凝法对漂洗液中蛋白质进行回收和分析，旨在为淡水鱼糜加工过程中漂洗废水的回收处理提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

鲢鱼：鲜活，体重2～3kg／条，购于无锡某农贸市场；

四甲基乙二胺（TEMED）：纯度≥99%，美国Sigma公司；

丙烯酰胺、N，N”－亚甲基双丙烯酰胺：

纯度＞98%，瑞士Fluka Biochemica公司；

β－巯基乙醇：纯度98%，美国Amresco公司；

蛋白质分子量标准：宝生物工程（大连）有限公司；

其它试剂：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

高速冷冻离心机：4K－15型，德国Sigma公司；

紫外－可见分光光度计：UV－1000型，上海天美科学仪器有限公司；

pH 计：320－s型，梅特勒－托利多仪器上海有限公司；

多功能食品加工机：SQ2119DX 型，上海帅佳电子科技有限公司；

电泳仪：DYY－8C型，北京市六一仪器厂。

1.2 试验方法

1.2.1 鱼糜漂洗液制备 将新鲜鲢鱼去头、内脏，清水冲洗干净后，采肉机采肉。漂洗时控制鱼肉与水的比例为1∶4（m∶V），先慢速搅拌6min，再静置10min，之后用4层纱布过滤，得到漂洗液置于4 ℃冰箱中备用（冷藏时间不超过24h）。在漂洗过程中应控制温度不超过10 ℃。用清水漂洗两次后，第3次漂洗采用0.3% （m∶V）盐水漂洗。所得到的3次漂洗液依次记为WS－Ⅰ，WS－Ⅱ和WS－Ⅲ。

1.2.2 调节pH 法回收漂洗液蛋白质 分别取30mL 鱼糜漂洗液于100 mL 烧杯中，用1 mol／L HCl调节漂洗液pH至pH 3.0～6.0（以0.5为梯度），漂洗液用蒸馏水分别补至40mL，然后在设定温度条件下（4，21，30 ℃）静置30min后4 000r／min离心10min，测定上清液的体积和蛋白质浓度，计算蛋白质回收率。

1.2.3 褐藻胶絮凝法回收漂洗液蛋白质 分别取30mL鱼糜漂洗液于100mL锥形瓶中，用1mol／L HCl调节漂洗液pH 至3.0～6.0（以0.5为梯度），漂洗液用蒸馏水分别补至40mL，然后按100mg／L 添加1%褐藻胶溶液，锥形瓶用保鲜膜封口，放入摇床中，摇床参数设置为20 ℃，120r／min，5min后取出静置30min，4 000r／min离心10min，收集上清液，测定上清液的体积和蛋白质浓度，计算蛋白质回收率。

1.3 分析方法

1.3.1 pH 的测定 采用pH 计直接测定。

1.3.2 蛋白质浓度测定 采用双缩尿法。

1.3.3 蛋白质回收率计算 按式（1）计算：

1.3.4 SDS－PAGE 电泳 采用Laemmli法。将电泳蛋白样品与等体积的SDS－PAGE 样品处理液（0.125 mol／L pH 6.8Tris－HCl缓冲液，4%SDS，20%甘油，10%β－巯基乙醇，0.005% 溴酚蓝）混合，沸水加热5min后，采用4%的浓缩胶和12%的分离胶进行SDS－PAGE 电泳。起始电泳电压为80V，待样品进入分离胶后改为120 V。电泳完成后，采用考马斯亮蓝R250染色，用醋酸甲醇溶液进行脱色。

蛋白质分子量标准混合物：肌球蛋白（200kDa），β－半乳糖苷 酶（116 kDa），磷 酸 酶b（97.2 kDa），牛 血 清 蛋 白（66.4kDa），卵清蛋白（44.3kDa），磷酸苷酶（29.0kDa），胰蛋白酶抑制剂（20.1kDa），溶菌酶（14.3kDa）。

1.4 统计分析

每组试验重复3次，取其平均值。所有数据采用Excel作图，采用SPSS 11.0软件对数据进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 鱼糜漂洗液中蛋白含量和组成分析

由图1可知，鱼糜漂洗液中含有大量的蛋白质，3次漂洗液中蛋白质浓度分别为WS－Ⅰ（12.37±0.09）mg／mL，WS－Ⅱ（3.12±0.09）mg／mL，WS－Ⅲ（1.75±0.07）mg／mL，随着漂洗次数的增加，漂洗液中蛋白含量逐渐减少。由图2 可知，漂洗液WS－Ⅰ中蛋白质分子量分布在20.1～97.2kDa，其中主要蛋白组分集中在44.3kDa左右。漂洗液WS－Ⅱ和WS－Ⅲ中的蛋白质分子量也大部分处于29.0～66.4kDa，但含量比WS－Ⅰ显著减少。因此，在蛋白回收研究中采用漂洗液WS－Ⅰ。

2.2 pH 值和温度对蛋白回收效果的影响

图1 不同漂洗阶段漂洗废水中蛋白质含量Figure 1 Protein concentration in surimi washwater at different wash stages

图2 漂洗废水中蛋白质SDS－PAGE电泳图Figure 2 SDS－PAGE patterns of proteins in surimi wash－water at different stages

蛋白质是带有正电荷和负电荷基团的两性电解质，pH值能够改变氨基酸残基侧链的电荷分布和蛋白分子带电基团的电荷数量。当环境pH 值偏离等电点越近，蛋白分子所带的静电荷越少，蛋白分子在等电点处所带静电荷为零，蛋白分子间的静电斥力最小，蛋白分子趋于聚集沉淀。因此调节pH 值的变化能够降低或增加蛋白质之间的相互作用，从而影响蛋白质聚集沉淀。

不同pH 和温度条件下鱼糜漂洗液中蛋白回收效果见图3。由图3可知，在3个处理温度条件下，随着鱼糜漂洗液pH 的降低，蛋白回收率均呈现先增加后降低的趋势，在pH 5.0处蛋白回收率均达到最大，在4，21，30℃3个不同处理温度条件下蛋白质最大回收率分别为42.73%，47.40%和54.81%。Bourtoom 等［1］通过调节pH 值对金线鱼（threadfin bream）鱼糜漂洗液中蛋白质的回收研究中发现，蛋白回收率随pH 的下降而下降，在pH 3.5除蛋白回收率最大，为66.3%。Chen等［11］通过等点聚焦电泳（IEF）研究发现鱼肉水溶性蛋白组分的等电点在3.5～5.2，5.85～6.55 和7.35～8.15处。温度对蛋白回收效果有显著影响，在选择的3个处理温度条件下，蛋白回收率随着温度的增加而逐渐增加，这与Bourtoom 等的研究报道［1］一致。

图3 不同pH、温度对蛋白质回收效果的影响Figure 3 Effect of pH and temperature on recovery of proteins in surimi wash water

由图4可知，不同温度条件下所得上清液中蛋白质电泳图谱相似，表明处理温度对回收蛋白质组成影响不大。但不同pH 条件下上清液中蛋白电泳图谱条带显著不同，随着pH 的降低，较高分子量蛋白条带，尤其是分子量在44.3kDa左右的蛋白质电泳条带逐渐变淡，而低分子量蛋白质（14.3～20.1kDa）的电泳条带强度逐渐增加，表明随着pH的降低，较高分子量蛋白质部分水解为低分子量蛋白质，而且当pH 值低于5.0 时，蛋白降解愈加明显。由电泳图谱（图4）可知，当pH 小于5.0时蛋白回收率逐渐下降可能是由于在较低pH 条件下蛋白分子降解为低分子量的多肽，蛋白溶解性增加，导致沉淀回收的蛋白质量减少。

2.3 pH 值对褐藻胶絮凝回收蛋白效果的影响

图4 不同pH、温度对离心上清液中蛋白质SDS－PAGE图谱的影响Figure 4 Effect of pH and temperature on SDS－PAGE patterns of protein in supernatant

图5 pH 对褐藻胶絮凝回收漂洗液中蛋白质效果的影响Figure 5 Effect of pH on protien recovery from surimi wash water using alginate

褐藻胶作为絮凝剂已广泛用于食品加工废水处理中。由图5可知，pH 对褐藻胶絮凝回收蛋白效果影响显著，且褐藻胶絮凝回收率随pH 的变化与单独调节pH 的蛋白回收率变化趋势一致。随着pH 的降低褐藻胶絮凝回收率呈现先增加后降低的趋势，在pH 5.0时蛋白回收效果最好，蛋白回收率回收率达到70.25%。海藻胶絮凝法与调节pH 法相比，当pH 小于3.5时，海藻胶絮凝法回收蛋白质没有优势；当pH 大于3.5时，在相同pH 条件下海藻胶絮凝法的蛋白回收率较单独调节pH 法显著提高，在pH 5.0时褐藻胶絮凝回收率比单独调节pH 的空白组回收率（47.40%）高出22%。结果表明，褐藻胶絮凝法结合调节pH 法可显著提高漂洗废水中蛋白质的回收效果。张宗恩等［10］研究发现，褐藻胶回收鱼糜漂洗液中的蛋白质在pH 3.78～4.92范围内具有较好的回收效果。

3 结论

（1）鲢鱼糜漂洗液中含有大量较低分子量的水溶性蛋白质组分，且蛋白质主要集中在第1次漂洗液中，生产过程中需重点对第1次漂洗液中蛋白质进行回收利用。

（2）通过调节鱼糜漂洗液pH 值和控制适当的处理温度可有效回收漂洗液中的蛋白质。该方法操作简单，但单独调节pH 法的蛋白回收率不是很高，调节pH 法结合褐藻胶絮凝法可显著提高漂洗液中蛋白质的回收效果。

（3）本试验虽比较了不同方法对鱼糜漂洗液中蛋白质的回收效果，但对于回收蛋白质的功能性质和应用还需进一步研究。

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10 张宗恩，汪之和，肖安华，等.鱼糜漂洗液中水溶性蛋白质的回收与利用［J］.上海水产大学学报，1999，8（1）：59～62.

11 Chen T Y，Shiau C Y，Noguchi T，et al.Identification of puffer fish species by native isoelectric focusing technique［J］.Food Chemistry，2003，83（3）：475～479.