高效液相色谱法同时测定水产品中氨基甲酸酯类的残留

洪 波 万译文 刘伶俐 刘 丽

（湖南省水产科学研究所，湖南 长沙 410153）

氨基甲酸酯类农药是一类广谱性农药，在农作物栽培过程中，特别是在种子处理上，氨基甲酸酯类杀虫剂得到广泛的应用。然而，当此类物质进入到水体后会在鱼体和其它水生生物体内富集，被认为是对养殖环境和人类有害的药物，因此很有必要加强对水产品中该类物质的监测。

目前中国还没有制定相应的水产品检测国家标准，据报道的关于动植物源性食品中氨基甲酸酯类农药的测定方法有气相色谱法［1］、气相色谱／质谱联用法（GC／MS）［2］、高效液相色谱法［3－5］、超临界流体色谱法［6，7］、高效液相 色 谱－串联质谱法［8，9］。在采用凝胶渗透 净 化技术［10］净化样品，以高效液相色谱法－紫外检测器检测过程中发现，凝胶渗透净化技术能分离大分子类干扰杂质，但用在水产品检测上存在分离不完全和溶剂用量大的缺陷。本试验采用丙酮／二氯甲烷提取水产品试样，提取液经浓缩后，采用固相萃取技术进行净化处理再浓缩定容，样品使用带紫外检测器的高效液相色谱进行检测，以期为水产品中氨基甲酸酯类农药多组分残留的实验室检测方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂、仪器与供试样品

1.1.1 试剂

丙酮、二氯甲烷、甲醇：色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

乙腈：色谱纯，美国Tedia公司；

氯化钠：优级纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

磷酸：分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；

甲醇－二氯甲烷（V／V ＝5／95）：天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器

高效液相色谱仪（配紫外检测器）：Waters2489，美国Waters公司；

旋转蒸发器：RE－52AA，上海亚荣生化仪器厂；

高速冷冻离心机：Z323K，德国Hemel公司；

超声波清洗器：KQ5200DE，昆山超声波仪器厂；

氨基固相萃取柱：500mg／6mL，美国Varian公司。

1.1.3 供试样品

草鱼、对虾、鳕鱼：均为无公害检测的阴性样，市售。

1.2 标准溶液配置

1.2.1 标准储备液的配制 分别称取涕灭威、甲萘威、克百威各5mg，速灭威、异丙威各10 mg，用甲醇溶解并定容至10.0mL，冰箱－18 ℃保存。涕灭威、甲萘威、克百威溶液浓度5g／L，速灭威、异丙威溶液浓度10g／L。

1.2.2 混合标准溶液的配制 分别吸取1.2.1中标准溶液各2.0mL置于10mL容量瓶中，加流动相至刻度。此溶液含涕灭威、甲萘威、克百威各1.00 mg／L，速灭威、异丙威各2.00mg／L。

1.3 样品处理

准确称取20.00g捣碎、混匀的样品于100 mL 具塞塑料离心管中，加入5g无水硫酸钠和混合提取液（25mL丙酮＋25mL二氯甲烷＋200μL 磷酸），均质1min，加入6g氯化钠，超声提取10 min，5 000r／min离心10 min，取25 mL提取液到鸡心瓶中旋转蒸发浓缩至干，加入2mL 乙腈溶解残渣，待过柱。

用乙腈活化氨基固相萃取柱，转移提取液到柱上，然后在鸡心瓶中加入2mL乙腈重复清洗1次，一并转移到柱上。继续用5mL 乙腈清洗柱子，最后用4mL 的甲醇－二氯甲烷溶液洗脱，收集洗脱液用40 ℃氮吹干。用流动相溶解残渣，并定容到1mL，过0.45μm 滤膜供液相色谱测定。

1.4 色谱条件

色谱柱：Waters ODS－C18柱（250mm×4.6mm，5μm），柱温35 ℃，进样量20μL，流动相：甲醇＋水＝50＋50，流速、吸收波长时间变化（见表1）。

2 结果与讨论

2.1 提取液的选择

参照文献［4］、［11］和［12］，分别对不同提取液（①25mL乙腈；②25mL乙腈＋200μL磷酸；③25mL甲醇；④25mL丙酮＋25mL二氯甲烷＋200μL磷酸）进行试验。试验结果表明：用提取液①进行提取时干扰物质会大量富集在提取液中且难以除去；用提取液③进行提取时同样会有干扰物过多的富集且涕灭威、异丙威回收率仅在30.50%～46.20%；用提取液②进行提取时虽减少了富集问题却出现速灭威的回收率很低的情况；而选择提取液④对分析无干扰，且提取效果好，回收率均在62.40%以上，故而选择25 mL 丙酮＋25mL二氯甲烷＋200μL磷酸进行后续试验。

表1 流速、吸收波长时间变化表Table 1 Velocity，absorption wavelength change of time table

2.2 净化方式的选择

经凝胶层析柱净化和氨基固相萃取柱净化方式的比对试验，并参考加速溶剂萃取方法［3］和超临界流体萃取方法［6］。试验发现：采用磷酸沉淀蛋白后，使用氨基固相萃取小柱（图1）对提取液进行净化和浓缩的效果与GB／T 5009.163——2003净化方式（图2）相比较，固相萃取净化方式具有节省时间、溶剂用量少、不易乳化等特点。氨基固相萃取柱对氨基甲酸酯类农药几乎没有保留，通过固相柱后，可有效除去样品的杂质干扰物，从而起到更好净化的效果。

2.3 最大吸收波长的选择

试验使用5种氨基甲酸酯混合标准工作溶液，在紫外吸收 区域选取了吸收波长为190，195，200，205，210，220，250nm的7个点，分别进行进样分析，记录5种氨基甲酸酯的在不同吸收波长下的峰面积见表2。结果表明：在195nm波长时（图3）涕灭威、速灭威、克百威、异丙威有最大的吸收峰，而甲萘威的最大吸收波长为220nm（图4）。以此，最终选用样品分析时及时变换195，220nm（图5）两个吸收波长来对样品进行测定。

图1 氨基固相萃取柱净化分析色谱图Figure 1 SPE chromatography purification of amino analysis diagram

图2 凝胶层析柱净化分析色谱图Figure 2 Gel chromatography purification of amino analysis diagram

2.4 线性范围和最低检出限

分别吸取1.2.2中溶液0.50，1.00，5.00，10.0mL置于10mL容量瓶中，用流动相定容，溶液中涕灭威、甲萘威、克百威的浓度各为0.05，0.10，0.50，1.00，2.00μg／mL，速灭威、异丙威的浓度各为0.10，0.20，1.00，2.00，4.00μg／mL，等体积进样进行分析检测，绘制标准曲线，结果表明：在上述浓度范围内，峰面积与溶液浓度呈良好的线性关系，线性方程与相关系数见表3。

表2 5种氨基甲酸酯的在不同吸收波长下的峰面积Table 2 5kinds of carbamate in different absorption wavelength of peak area

图3 195nm 时5种氨基甲酸酯分析图谱Figure 3 195nm 5carbamate analysis map

图4 220nm 时5种氨基甲酸酯分析图谱Figure 4 220nm 5carbamate analysis map

图5 变波长时5种氨基甲酸酯分析图谱Figure 5 Variable wavelength of 5carbamate analysis map

表3 5种氨基甲酸酯线性范围和最低检出限Table 3 5kinds of carbamate linear range and detection limit

2.5 方法回收率

在鱼糜样品中分别加入浓度为0.20，1.00μg／mL 的5种氨基甲酸酯农药的混合标准溶液进行方法回收率试验。由表4 可知，5 种氨基甲酸酯农药的加标平均回收率在62.40%～90.25%，相对标准偏差均在1.46%～9.32%，5种氨基甲酸酯回收率都很高，而且重复性和可现性都很好，其中涕灭威的平均回收率最高，达90.25%。

3 结论

本方法是在文献［13］、［14］的基础上，从改变吸收波长降低检出限方面进行改进。但使用变波长会使基线产生一定波动，所以要求样品中各组分之间要一定的保留时间差。后续研究考虑将梯度洗脱方法运用于此样品分析中，期望可以得到更好的分离效果和缩短分析时间。

表4 5种氨基甲酸酯回收率Table 4 5kinds of carbamate recycle rate

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