PCR 法快速检测耐热霉菌雪白丝衣霉

张 慧 郑晓冬 姜 侃 汪 新 陈小珍

（1.浙江省质量检测科学研究院食品检测部，浙江 杭州 310013；2.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江 杭州 310058）

耐热性霉菌是引起果蔬汁饮料腐败的重要原因之一［1－3］。它可产生子囊孢子，能够耐受巴氏杀菌或UHT 杀菌而存活下来，并能在缺氧的环境中生长，抗热能力比其它霉菌强很多。受耐热霉菌污染的果汁，在贮存期间易发生变色、分层、胖听等，甚至产生丝衣霉毒素A、棒曲霉素等有毒的次生代谢产物［4－6］，给食品安全带来隐患，也给企业带来经济损失。一些企业尤其是出口型企业，为满足国际需求，通常要求产品中耐热霉菌不得检出。目前耐热霉菌的检测通常采用PDA 平板培养法，但检测时间较长［1］，影响了果蔬汁产品的快速流通。为保障国内外消费者的健康安全，急需寻找一种能够快速检测鉴别果汁中耐热霉菌的方法。

雪白丝衣霉菌是果汁中易污染的耐热霉菌之一［7－9］，本试验根据雪白丝衣霉菌的beta－tubulin 基因序列，通过设计引物、条件优化等建立PCR 快速检测方法，力图快速、准确检测果汁中雪白丝衣霉菌污染，为产品质量控制提供技术基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌株

本试验所用菌株见表1。

1.1.2 主要仪器

电子天平：AB104－N，上海第二天平仪器厂；

梯度PCR 仪：Veriti 96孔，美国应用生物系统公司；

电泳仪：Bio－Rad PowerPace Basic，美国伯乐公司；

自动凝胶成像系统：Bio－Rad Gel Doc XR，美国伯乐公司；

高速离心机：Microfuge 16，贝克曼库尔特商贸有限公司。

1.1.3 主要试剂

Biospin真菌基因组DNA 提取试剂盒：杭州博日科技有限公司；

2×NI－Taq PCR MasterMix试剂、DL2 000DNA Marker、琼脂糖：上海位点生物科技有限公司。

表1 试验菌株Table 1 Strains for test

1.2 试验方法

1.2.1 菌株培养 雪白丝衣霉菌接种于马铃薯葡萄糖培养基，25 ℃培养3～5d，挑取菌丝体或菌丝球提取真菌DNA。

1.2.2 模板DNA 制备 真菌DNA 提取采用Biospin真菌基因组DNA 抽提试剂盒，操作步骤严格按照说明书进行。

1.2.3 引物设计 雪白丝衣霉菌引物设计参考GenBank CBS133.37beta tubulin的部分基因序列，雪白丝衣霉菌引物序列见表2，所有引物均由Invitrogen公司合成。

表2 引物组与退火温度Table 2 Specific primer sequences and annealing temperatures

1.2.4 用于引物筛选的PCR 反应体系和PCR 反应体系的优化 雪白丝衣霉菌的引物筛选和退火温度的优化同时进行，引物筛选时，使用雪白丝衣霉菌的引物，分别使用雪白丝衣霉菌（ATCC22260）、纯黄丝衣霉（ATCC24474）、宛氏拟青霉（CICC4024）、费氏新萨托菌（ATCC24474）的DNA 模板，通过不同退火温度下引物的特异性筛选出合适的引物。

PCR 反应条件：95 ℃（5min），98 ℃（10s）、梯 度 退火温度（30s）、72℃（30s）、35个循环，72℃（5min）；做梯度PCR进行引物筛选和条件优化时，退火温度梯度选择：55，57，59，61，63，65 ℃。4 ℃保存。

引物浓度的优化：使用优化的退火温度，引物的终浓度分别达到0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5μmol／L，进行PCR 试验。

表3 PCR 反应体系组成Table 3 PCR reaction

1.2.5 特异性验证 分别应用2株雪白丝衣霉菌和6株非雪白丝衣霉菌，提取其基因组DNA 进行PCR 检测，验证该方法检测雪白丝衣霉的特异性。

1.2.6 灵敏度试验 以标准菌株：雪白丝衣霉ATCC22260为参考菌株，进行灵敏度测定，将菌株DNA 提取液进行10倍梯度稀 释，使DNA 浓度 约 为10，1，10－1，10－2，10－3，10－4ng／μL，DNA 模板用量为1.0μL，应用以上DNA 进行PCR 检测，电泳观察结果。

1.2.7 PCR 产物电泳 取5μL PCR产物，应用琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条件为0.5×TBE、2.0%琼脂糖凝胶、150V电压条件下电泳30min，凝胶电泳成像系统观察扩增结果。

2 结果与分析

2.1 引物的筛选和退火温度的优化

运用梯度PCR 方法对雪白丝衣霉进行扩增，并对该菌不同退火温度下的引物特异性进行考察，使用两对引物进行PCR 反应，扩增产物电泳检测结果见图1、2。使用Bn－1引物的雪白丝衣霉（图1）在退火温度55，57，59，61，63 ℃时，123bp处均有目的条带出现，59 ℃时呈现最强荧光，而在这些退火温度均无非特性扩增出现，说明引物适合雪白丝衣霉的DNA 扩增，并具有良好的特异性。使用Bn－2引物进行梯度PCR 反应时（图2），雪白丝衣霉在55，57，59，61 ℃时，均有72bp的目的条带出现；同时，纯黄丝衣霉在这几个温度均有明显的非特异性扩增，退火温度提升到63 ℃时，纯黄丝衣霉非特异性扩增消失，但此时雪白丝衣霉的条带亮度很弱；宛氏拟青霉在55，57 ℃时也出现了非特异性扩增，但随着退火温度的升高，非特异条带逐渐减弱，退火温度达到59 ℃以上时，即可消除宛氏拟青霉非特异扩增的影响。

综合考虑，选择扩增后有目的条带出现，并且引物特异性较好的Bn－1引物，作为雪白丝衣霉PCR 扩增的引物；选择59 ℃作为以后PCR 扩增的退火温度。

图1 雪白丝衣霉（使用Bn－1引物）梯度PCR 反应产物电泳结果Figure 1 Electrophoresis of Gradient PCR products of Byssochlamys nivea

图2 雪白丝衣霉（使用Bn－2引物）梯度PCR 反应产物电泳结果Figure 2 Electrophoresis of Gradient PCR products of Byssochlamys nivea（Bn－2primers）

2.2 引物浓度的优化

按照筛选的引物和优化的退火温度，对引物浓度进行优化试验。由图3可知，除了引物终浓度在0μmol／L 时没有条带，引物浓度在0.1μmol／L 以上的均在预期位置扩增出清晰的目的条带。因此，从0.1～0.5μmol／L均可满足PCR对引物浓度的要求。既保证条带明亮、清晰，又考虑到节约成本，选用0.2μmol／L为优化的引物终浓度。

2.3 特异性试验

特异性试验结果见图4。2 株雪白丝衣霉均呈阳性扩增，其它几种霉菌和细菌的检测结果均为阴性，说明该法只与雪白丝衣霉发生特异性反应，不与其它真菌或细菌菌株产生交叉反应，设计的引物特异性很强，与预期结果相符。

2.4 灵敏度试验

图3 引物浓度对PCR 扩增的影响Figure 3 Effect of primers concentration on PCR amplification

图4 雪白丝衣霉及非雪白丝衣霉PCR 反应产物电泳结果Figure 4 Electrophoresis of PCR products of Byssochlamys nivea and non－Byssochlamys nivea

图5 雪白丝衣霉PCR 检测灵敏度Figure 5 Sensitivity of PCR for Byssochlamys nivea

分别以不同的雪白丝衣霉DNA 模板浓度对PCR 方法的检测灵敏度进行测试。由图5可知，随着DNA模板浓度的降低，反应条带的亮度呈梯度下降，当DNA 模板浓度降至1ng／μL时仍可见较为明亮的目的扩增条带，因此检测灵敏度约为1ng／PCR 反应体系。

3 讨论

本试验根据Genbank公布的耐热性霉菌——雪白丝衣霉的beta－tubulin基因序列，设计了两对引物，参考文献［10］并结合经验，初步设定反应体系与温度循环和退火温度的梯度程序，通过两对引物PCR 扩增效果的对比，发现引物Bn－1既能扩增出目的DNA 片段，又具有良好的特异性；59 ℃的退火温度和0.2μM／PCR 反应体系的引物浓度，在满足试验需求的同时，也节约了成本，为PCR 反应的最佳条件；以优化的PCR 条件对雪白丝衣霉和非雪白丝衣霉进行PCR 检测，试验结果表明所建立的PCR 方法对雪白丝衣霉具有良好的特异性，方法基因组DNA 的灵敏度为1ng／PCR 反应体系，检测灵敏度好。雪白丝衣霉PCR 检测方法的建立，为果汁中耐热霉菌的快速检测和鉴别提供了试验数据。

1 郭伟鹏，吴清平，张菊梅，等.果汁饮料中耐热霉菌的分离和鉴定研究［J］.生物技术通报，2008（增刊）：244～247.

2 祝红昆.耐热性霉菌引起果蔬汁饮料腐败问题的实验探讨［J］.云南大学学报（自然科学版），2008，30（S1）：359～362.

3 郝天婷，周帼萍.2例果汁饮料中污染真菌的鉴定分析［J］.中国酿造，2010（9）：155～157.

4 Sant’Ana A S，Simas R C，Almeida C A，et al.Influence of package，type of apple juice and temperature on the production of patulin by Byssochlamys nivea and Byssochlamys fulva［J］.Int.J.Food Microbiol，2010，142（1－2）：156～163.

5 Tournas V.Heat－resistant fungi of importance to the food and beverage industry［J］.Crit Rev Microbiol，1994，20（4）：243～263.

6 Dombrink－Kurtzman M A，Engberg A E.Byssochlamys nivea with patulin－producing capability has an isoepoxydon dehydrogenase gene（idh）with sequence homology to Penicillium expansum and P.griseofulvum ［J］.Mycol Res.，2006，110（9）：1 111～1 118.

7 Silva F V，Gibbs P.Target selection in designing pasteurization processes for shelf－stable high－acid fruit products［J］.Crit Rev Food Sci.Nutr.，2004，44（5）：353～360.

8 Bayne H G，Michener H G.Heat resistance of Byssochlamysascospores［J］.Appl.Environ.Microbiol.，1979，37（4）：449～453.

9 Butz P，Funtenberger S，Haberditzl T，et al.High pressure inactivation of Byssochlamys niveaascospores and other heat resistant moulds［J］.LWT－Food Science and Technology，1996，29（5）：404～410.

10 Motolazu Nakayama，Kouichi Hosoya，Tetsuhiro Matsuzawa，et al.A rapid method for identifying Byssochiamys and Hamigera［J］.Journal of Food Protection，2010，73（8）：1 486～1 492.