新型层析快速检测技术及其在食品安全中的应用

刘道峰邓省亮赖卫华

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西省科学院微生物研究所，江西 南昌 330029）

新型层析快速检测技术及其在食品安全中的应用

刘道峰1邓省亮2赖卫华1

（1.南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047；2.江西省科学院微生物研究所，江西 南昌 330029）

分别介绍量子点、荧光微球、上转磷光、纳米磁珠为代表的新型标记物免疫层析，非免疫学层析，替代抗原层析等新型层析快速检测技术，综述其原理、优势及其在食品安全相关领域的应用现状，并对今后层析检测方法的发展趋势进行展望。

新型；层析检测；食品安全；应用

目前，以胶体金标记为代表的免疫层析方法已广泛应用于食品安全相关检测中。胶体金（colloidal gold）是氯金酸在还原剂的作用下，形成可控大小的金颗粒，在试纸条上金颗粒聚集达到一定密度时，能出现肉眼可见的粉红色，因而胶体金可以标记生物分子并作为免疫层析反应的指示物。目前，对于胶体金免疫层析检测方法，中国已初具产业化规模并有较多成熟产品问世，如：检测盐酸克仑特罗试纸条灵敏度已达到2ng/mL，莱克多巴胺检测限已达到3ng/mL。

类似常用的还有胶体硒、乳胶微球等吸收光谱型标记物［1－3］，但由于这些传统层析检测方法有一定弊端，如此类物质物易受光学干扰，仅能定性或半定量分析，且要求标记物大量聚集至一定浓度后才能产生可视的信号（如胶体金需达到107个/mm2，才会形成肉眼可见的红色［4］），因此，这也限制了传统层析方法在食品安全领域的广泛应用。

1 新型标记物免疫层析法及其在食品安全中的应用

目前，已经应用于免疫层析标志物的新型纳米材料包括量子点（quantum dots，QDs）、荧光微球、上转磷光纳米粒子（up－converting phosphor，UCP）、纳米磁珠等几大类。这些新兴的标记方法有效规避了吸收光谱型标记物须大量聚集才能显色的缺点，也有效减少了样本的本底干扰，在层析检测中显示了更大的潜力。

1.1 量子点标记免疫层析

量子点（quantum dots，QDs）又称荧光半导体纳米颗粒，用于生物探针的量子点主要由第二副族和第六主族的元素组成，如硒化镉（CdSe）、硫化锌（ZnS）、碲化镉（CdTe）、硫化镉（CdS）等［5］。粒径多介于1～10nm，极小的粒径，外观似点状，故得名为量子点。

受量子尺寸效应和量子限域效应的影响，半导体量子点显示出独特的发光特性［6］，主要表现在：① 其发光特性除了与量子点的材料相关外还与其颗粒尺寸密切相关，一定范围内，粒径越大，发射光的频率越低，波长越长；② 激发光谱很宽，可以使用小于其发射波长10nm的任意波长激发光来激发量子点，而量子点的发射光谱谱峰较窄且无拖尾，单色性好，因此可以用同一激发光源来激发不同的量子点，这使得在同一系统中同时检测多个项目中量子点有了极大优势；③量子点有着很大的Stoke位移，可有效避免激发光与发射光的重叠，这使得发射光的判别更为明显，检出更为容易，更有利于提高检测灵敏度；④ 量子点具有远大于生物分子的荧光寿命，在大部分生物分子荧光猝灭后，可以有效地降低自然本底的干扰。此外，经一系列化学修饰后的量子点可以拥有稳定的水溶特性与更好的生物相容性［7－9］。经稳定的核壳包裹的量子点也显示出更好的光化学稳定性与更低的细胞毒性。所以，近年来在食品安全相关的层析检测中受到了研究者较热门的关注，有着较广泛的应用［10，11］。

Zou等［12］报道了一种新的检测有机磷农药－毒死蜱（三氯吡啶醇，trichloropyridinol）残留的传感器，该传感器基于量子点标记免疫层析方法并结合一便携式量子点层析试纸条的读取仪。据读取仪扫描T线（检测线）量子点光强度，可以将检测结果定量化，在最佳条件下，该传感器有较宽的线性范围，标准品最低检出浓度为1.0ng/mL。实现了以量子点标记免疫层析为基础的待测物的“超灵敏”定量分析。Tully等［13］也将量子点标记免疫层析方法应用于单增李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）外膜蛋白的检测，验证了抗Int A及Int B两组蛋白的单抗对李斯特氏菌检出的有效性，对李斯特氏菌的最低检出浓度为1.5×104CFU/mL。张国华等［14］应用该方法检测莱克多巴胺（ractopamine，Rac），所得的Rac快速检测试纸条的检测限为3ng/mL。Peng等［15］通过量子点－BSA－生物素－亲和素－抗体作为结合垫探针，建立了能同时检测5种化学物残留的间接竞争免疫层析法，其中，地塞米松（dexamethason，DEX）的定量检测线性范围为0.33～10μg/kg，庆大霉素（gentamicin，GM）0.28～10μg/kg，氯硝安定（clonazepam，CZP）为0.16～25μg/kg，头孢噻呋（ceftiofur，CEF）0.32～25μg/kg，甲孕酮（medroxyprogesterone acetate，MPA）0.17～10μg/kg，同时检测上述物质的最低检出浓度：DEX，0.13μg/kg；GM，0.16μg/kg；CZP，0.07μg/kg；CEF，0.14μg/kg；MPA，0.06μg/kg。检测加标猪肉样本并与传统方法比对，准确性较高，显示了量子点在体系中同时检测多种物质的优势。

1.2 荧光微球标记免疫层析

荧光微球是指将荧光染料通过物理吸附法、自组装法、化学键合法、共聚法、包埋法等［16］方法吸附或包埋到粒子内而形成的直径在纳米至微米级（0.01～10μm）范围内，受激发光源激发能发出荧光的固体微粒。在微球壳结构的作用下，它具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性。形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响［17］。

Nathalie等［18］以包裹磺酰罗丹明B的微球为标记物的免疫层析方法检测葡萄球菌肠毒素B，整个检测时间为30min，在缓冲液中检测限接近20pg/mL，加标于不同样本基质，灵敏度依然能够得到保持，优于相同条件胶体金标记层析法（0.312ng/mL）约15倍，加之，因荧光微球有效防止了荧光染料向溶液中泄露，检测限更优于直接标记罗丹明染料的层析方法（0.625ng/mL），该方法与其他主要细菌毒素均无交叉反应，展示了荧光微球标记免疫层析的明显优势。范放等［19］以荧光纳米颗粒为标记物，研制了检测O139群霍乱弧菌的免疫层析试纸条，用该试纸条检测人工污染O139群霍乱弧菌的海鱼肉，检测灵敏度为3.5×104CFU/mL，比前人［20］的胶体金免疫层析试纸条3.4×105高一个数量级。朱海等［21］将荧光微球与呋喃唑酮代谢物单克隆抗体共价耦联在一起，以竞争法作为反应模式来制备出呋喃唑酮代谢物免疫层析试纸条，所制备的免疫层析试纸条仅与呋喃唑酮代谢物AOZ有交叉反应，而与非目标检测物之间无交叉反应，其灵敏度达1.0ng/mL，可满足相关检测标准要求，通过肉眼观察检测线和质控线之间的亮度，还可进行半定量检测。

1.3 上转磷光标记免疫层析

上转磷光材料（up－converting phosphor，UCP）是新近发展起来的一种示踪纳米晶体颗粒材料，由包埋于氧化硫等惰性材料中的两种不同镧系元素离子（分别作为光吸收子和发射子）组成［22］。在红外线（波长＞780nm）激发下，上转磷光颗粒吸收2个或2个以上光子的低能量，并可发射更高能谱（更高频率）不同区段单波长的可见光（波长475～670nm），故为上转磷光［23］。由于上转磷光颗粒猝灭的时间更长和天然生物材料不具备上转磷光的特性［24］，所以检测可不受载体或样品自然磷光的干扰；加之，磷光上转发生于晶格中，故磷光颗粒的光学性质不受环境和加样条件的限制，使得上转磷光免疫层析技术灵敏度高，应用范围广。

王静等［25］建立了一种肠出血性大肠杆菌O157的上转磷光免疫层析快速检测方法，每次最低可检测500个细菌，对奶粉、咖啡粉、饼干、蛋糕、绿豆糕、果冻、燕窝、果汁等样品中的人工染菌均可检测，最低检测浓度为5×103CFU/mL。高于常规胶体金免疫层析试纸条10～100倍［26，27］，体现了上转磷光免疫层析方法简便快速，特异性和灵敏性好，适用于现场的快速检测的优势。郭艳宏等［28］合成了稀土铕2SiO2纳米颗粒，用其与氯霉素单克隆抗体结合制备氯霉素类残留物免疫检测探针，并制备免疫层析试纸条，用于牛奶中氯霉素和氯霉素琥珀酸盐同步检测，简便快速，30min内出结果。加入1ng/mL的氯霉素、氯霉素琥珀酸盐均能阻断T线显色，与甲砜霉素、庆大霉素、磺胺二甲基嘧啶之间无交叉反应，特异性好，未发现非特异性吸附和基质背景荧光干扰的问题。Niedbala等［29］采用研制的UCP标记双抗夹心免疫层析法对E.coliO157∶H7进行检测，在含有109杂菌的25g牛肉阴性样本基质中最低加入的103CFU/mL目的菌，可在10min内被检出，且0到107CFU/mL间的变异系数均小于10%，稳定性好。同时也采用UCP标记竞争免疫层析法对多种兴奋剂进行检测，结果理想。Hong等［30］研制的检测鼠疫耶尔森氏菌抗体的10通道上转磷光免疫层析试纸条装置，可以同时检测多种鼠疫耶尔森氏菌抗体，与ELISA对照检测表现了较高的符合率 （R2＝0.93～0.99），平均变异系数为10.3%，表现了较好的稳定性。

1.4 纳米磁珠标记免疫层析

目前对指示物的检测基本上都是靠肉眼观察定性结果或者基于光电效应的仪器检测，在检测过程中，无论是肉眼还是光学仪器检测NC膜上T线和C线（质控线）上的信号，基本上只能检测到膜表面到其10μm以下的部分。通常使用的硝化纤维膜厚度为100μm级别，指示物质在纤维膜上层析时在整个膜上从底到顶均有分布，这样多达90%的指示物未被测量到，这对于检测的灵敏度是个极大的损失。纳米磁性颗粒（magnetic nanoparticle，MNs）现已被广泛应用于生物分离，酶的固定化，细胞的特异性捕获、浓缩等领域［31，32］，目前正在被尝试着用于取代传统免疫层析技术中指示物质。由于纳米磁性颗粒的“穿透性”，仪器对磁珠的磁信号检测可以不受膜的厚度的影响，能够检测膜上从底到顶所有的磁珠，便可有希望大大提高灵敏度。加之，食品生物类材料大都不具备磁性，选择磁性颗粒标记可有效避免本底干扰。

袁航［33］建立了磁标记用于大分子的双抗夹心及用于小分子的竞争免疫层析检测法，其中磁标记竞争免疫层析法以盐酸克伦特罗（clenbuterol）为目标物质，分别达到了现有ELISA 方法的灵敏度（0.5ng/mL），而检测时间缩短至20min，与成熟使用的胶体金检测试纸比对，所测107例样本，符合率达到100%，优于参比的产品。这确认了纳米磁珠标记免疫层析方法及其应用于食品安全检测的有效性。Wang等也进行了相关的研究［34］，结果表明，磁珠标记层析的检测时间主要跟磁珠粒径相关，而信号的强度主要由磁珠中磁性物质的含量有关，选用更小粒径与磁性物质含量更高的磁珠作免疫层析的标记物更有利于快速、灵敏度的纳米磁珠标记免疫层析。

2 新型非免疫学层析及其在食品安全中的应用

近年来互补的核酸链之间的特异性结合，也被研究者应用于层析方法中，新的物质也可以被层析的方法检出，由于它们的结合力更强、特异性更高而有望从反应动力学上提高检测灵敏度。

Wang等［35］利用核酸与核酸之间的特异性结合，通过量子点标记层析法对赭曲霉毒素A（ochratoxin A，OTA）进行检测。检测原理：结合垫用量子点标记一段核酸配子（核酸单链），而在T线喷涂能与该配子大部分区段特异性互补的另一条核酸链Probe1，C线再喷涂一条Probe2。当样本中存在OTA时，经过结合垫，会与标记量子点的配子作用，导致配子无法与T线（检测线）的Probe1杂交，而不显颜色，由于量子点标记配子的5′端有一段18个碱基的poly A，故无论样本是否含有OTA，配体都会与C线上的Probe2相结合，使C线显色，保证检测有效。该新型的层析方法检测限低至1.9ng/mL，完全满足WHO对OTA的限量要求。量子点标记配体的思路使检测的灵敏度高于胶体金免疫层析，更重要的是极高的选择性使方法尤其适于对复杂样本溶液的检测。

再如，商品化的 Milenia GenLine HybriDetect试剂盒，适用于任何扩增产物快速检测。只需要在设计扩增时，设计一条FITC标记的探针，和生物素标记的引物。其检测原理为生物素标记的PCR产物与FITC标记的特异探针杂交、FITC标记的特异探针与抗FITC抗体的金标物结合后，将该免疫复合物滴加到试纸条上，免疫复合物通过层析膜扩散到检测线时，生物素标记的扩增产物被生物素配体捕获，形成具有颜色的T线。不被捕获的免疫复合物继续扩散到质控线被特异性抗体所捕获，形成具有颜色的C线。已有研究者［36］将此层析方法结合环介导等温核酸扩增（LAMP）技术应用于转基因作物的快速检测，方便、快捷、成本低廉，有效增补了中国转基因食品的快速检测方法，有良好的应用前景。

3 新型替代抗原层析及其在食品安全中应用

当前，对于食品中有毒有害小分子抗原的层析检测方法通常是建立在以喷涂该小分子或蛋白－小分子偶联物作竞争抗原基础上的有毒检测体系。由于多数检测物标品昂贵、进口受限，毒性抗原还存在对层析检测产品的生产及使用操作人员的健康产生危害等问题，如黄曲霉毒素（AF）、赭曲霉毒素（OTA）等毒性强烈且标品难以获得，制约了层析检测方法的应用和推广。

20世纪80年代发展起来的噬菌体展示肽库技术，为传统的免疫学分析方法提供了新的思路。可将抗检测物的抗体作为靶分子，从噬菌体展示肽库中淘选出抗原的模拟表位，利用抗原模拟表位和目标分子能竞争结合抗体的特性，在层析检测系统中可以采用模拟表位替代传统的偶联抗原，从而达到检测的目的。

Lai等［37］建立了以模拟表位肽为竞争物的胶体金标免疫层析法，10ng/mL的OTA样本可在10min内被此方法检出，T线以筛选的模拟表位肽替代了OTA－BSA的复合物，避免了真菌毒素OTA的使用，为真菌毒素的免疫层析检测尝试了新的方法。

目前，关于模拟肽的筛选及其在免疫检测中的应用已成为研究的热点，相信有更多的成功筛选会被应用于层析检测方法中。

4 展望

在食品安全领域，高灵敏度、高选择性、多样性、定量化已成为层析检测方法的主流方向与发展趋势。如何使这些新技术更快地实现产业化并应用于实践，满足国家对不同样品及不同待检测物进行检测的要求，将成为研究者努力的方向。

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Application of novel chromatographic detection techniques for food safety

LIU Dao－feng1DENG Sheng－liang2LAI Wei－hua1

（1.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang，Jiangxi330047，China；2.Institute of Microbiology，Jiangxi Academy of Sciences，Nanchang，Jiangxi330029，China）

The novel chromatographic detection techniques were introduced，represented by nonimmune chromatography，immunochromatography based on mimotope peptide and immunochromatography with new labels，such as quantum dots，fluorescent microsphere，upconverting phosphor and magnetic nanobeads，and their application for food safety.The principle，advantages，the trend and prospect for development of chromatographic detection in the future were also discussed in the paper.

novel；chromatographic detection；food safety；application

10.3969 /j.issn.1003－5788.2011.06.069

国家自然科学基金项目（编号：30960301）

刘道峰（1988－），男，南昌大学在读硕士研究生。E－mail：defoelau＠163.com

赖卫华

2011－08－10