赵州雪花梨多酚氧化酶酶学特性研究

杨光宇牟德华赵广西葛 娜万 青

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.秦皇岛市产品质量监督检验所，河北 秦皇岛 066000；3.秦皇岛市出入境检验检疫局技术中心，河北 秦皇岛 066004）

赵州雪花梨多酚氧化酶酶学特性研究

杨光宇1牟德华1赵广西2葛 娜3万 青1

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北 石家庄 050018；2.秦皇岛市产品质量监督检验所，河北 秦皇岛 066000；3.秦皇岛市出入境检验检疫局技术中心，河北 秦皇岛 066004）

研究赵州雪花梨多酚氧化酶的酶学特性。结果表明：以邻苯二酚为底物，雪花梨中多酚氧化酶的最适pH值为7.0，最适温度为25℃；底物浓度与酶活成正相关，90℃处理4min可钝化其活性；酶反应动力学研究表明，以邻苯二酚为底物时，Vmax＝437U/min，Km＝0.015 6mM。

赵州雪花梨；多酚氧化酶；酶学特性

赵州雪花梨是河北省土特名产之一，至今已有2 000多年的栽培历史，主要分布在河北省中南部，赵县是著名的集中产区，故称“赵州雪花梨”。目前，赵州雪花梨主要用于鲜食，深加工产品有雪花梨罐头、梨脯、梨汁、梨酒等［1－2］。然而梨汁加工和贮藏过程中存在着严重的褐变现象，影响了产品的品质，降低了产品的市场竞争力［3］。

果蔬汁加工过程中的褐变主要是酶促褐变，以多酚氧化酶引起的酶促褐变最为明显。酶促褐变是多酚氧化酶催化果蔬中游离酚酸的羟基化反应以及羟基酚到醌的脱氢反应，醌在果蔬体内自身缩合或与细胞内的蛋白质反应，产生褐色色素或黑色素，从而发生褐变［4］。

多酚氧化酶（polyphenol oxidase，简称PPO）存在于许多果实中，是引起酶促褐变的主要酶类。水果种类不同，PPO的含量及其性质也大不相同。本试验以赵州雪花梨为原料，研究了赵州雪花梨中PPO的酶学特性，为赵州雪花梨在深加工中防止褐变提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

雪花梨：赵州雪花梨，从赵县梨园采摘后存放于冷库备用；

丙酮、邻苯二酚、抗坏血酸、异抗坏血酸、柠檬酸、草酸、三氯乙酸：均为市售分析纯。

1.2 设备

紫外分光光度计：SP－756P，上海光谱仪器有限公司；

医用离心机：LG10－2.4A，北京医用离心机厂；

九阳料理机：JYL－350，山东九阳小家电有限公司；

恒温水浴锅：DF－101S，巩义市英裕予华仪器厂；

电子分析天平：JJ100，美国双杰兄弟（集团）有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 PPO粗酶的提取 取雪花梨200g，切成小块，加入50mL冷丙酮（－22℃）混合打浆，加入100mL冷丙酮，充分搅拌后进行抽滤，将滤渣溶于100mL冷丙酮中，反复抽滤至滤渣为无色。滤渣在室温下干燥至恒重，加入100mL磷酸盐缓冲液（pH 6.8）4℃搅拌30min，经两层纱布过滤后，滤液在8 000r/m离心20min，取上清液为粗酶液，冷藏备用。

1.3.2 PPO活性的测定 以邻苯二酚为底物，加入缓冲液和酶液后，用紫外分光光度计检测反应液在420nm处的吸光度值（A值），每隔5s读取一次A值。依据曲线最初的直线部分计算酶活力。以在1min内引起吸光度变化0.001为一个酶活力单位（U）［5］。

1.3.3 PPO反应时间的确定 以邻苯二酚为底物，在25℃、pH 6.8的环境下加入粗酶液，反应进行1～10min，检测PPO活性的变化，确定适宜反应时间。

1.3.4 pH对PPO活性的影响 反应液中加入不同pH的缓冲液进行反应，测定不同pH时的酶活。pH范围取3～8，温度25℃。反应液总体积10mL，其组成：粗酶液0.1mL，邻苯二酚溶液2mL（0.2M），缓冲液7.9mL。

1.3.5 温度对PPO活性的影响 用恒温水浴锅调整不同的温度，使整个酶反应的体系处于不同的温度中反应一定时间，然后加入20%三氯乙酸终止反应，检测酶活。温度范围取20～70℃，反应液总体积10mL，其组成：粗酶液0.1mL，邻苯二酚溶液2mL（0.2M），缓冲液7.9mL。

1.3.6 PPO热稳定性的研究 用恒温水浴锅进行加热，每隔2min检测一次酶活。温度选取50，60，70，80，90℃，反应液总体积10mL（粗酶液0.1mL，底物0.2M邻苯二酚溶液2mL，缓冲液7.9mL）。

1.3.7 酶反应动力学的研究 在25℃、pH 6.8条件下检测底物添加量不同时的酶的活性，做出底物浓度－酶活的曲线，并用双倒数作图法做LB曲线求出Vmax和Km值，做出米氏方程。

2 结果与讨论

2.1 酶反应时间的确定

由图1可知，赵州雪花梨中的PPO在以邻苯二酚为底物，进行反应时，反应速度在180s内几乎是呈直线上升，随后反应速度变慢，为了正确测定酶促反应的速度，尽量避免各种因素干扰，本试验确定测定酶活的反应时间为180s。

图1 酶活与反应时间的关系Figure 1 The relationship of PPO activity with reaction time

检测时，比色皿中加入反应液以后放入紫外分光光度计中进行时间扫描，而反应液在比色皿中反应时，由于接触氧气以及溶液中各组分分布的原因，反应速度也不均匀，造成一部分反应快，一部分反应慢，反应完以后还有一个色素均匀分布的过程，造成200s以后A值的下降。

2.2 pH对PPO活性的影响

PPO是一类蛋白质，pH值过高或过低都会对蛋白构象产生影响，影响PPO的活性。由图2可知，雪花梨PPO的最适pH值在7.0左右，但是在5.0左右还有一个峰，原因是提取的粗酶液中可能存在着PPO的同工酶。这种现象在很多文献中都有报道：宗亦臣等［6］在枣的PPO的研究中也发现了同样的现象；Rocha等［5］在红乔纳金苹果的PPO研究中同样也发现了在5.0和7.5出现双峰的现象；Estrella Nu′1ez－Delicado等［7］在拿破仑葡萄PPO研究中发现双峰出现在4.0和6.0。所以，双峰的出现不仅和PPO同工酶有关，峰出现的位置还与水果的品种有关。

2.3 温度对PPO活性的影响

温度是影响酶活性的重要因素，研究酶的最适温度，在工业生产中有重要的意义。连毅等［8］研究了大蒜PPO的最适温度为40℃；徐芹等［9］研究砀山酥梨PPO最适温度为34℃；张福平等［10］研究佛手瓜PPO最适温度为30℃。此外还有许多文献研究了各种果蔬中的PPO的最适温度，大部分都在30～50℃之间。由图3可知，雪花梨PPO最适温度为30℃，随着温度的升高，PPO的活性明显下降，20～30℃酶活最高，酶的活性为381U。说明大部分果蔬中的PPO的最适温度相差不大。因此，酶的活性可能和果蔬的生长环境有关。

图3 温度对赵州雪梨PPO活性的影响Figure 3 Effect of temperature on the activity of PPO in Zhaozhou snow pear

2.4 PPO的热稳定性

研究PPO的热稳定性有助于确定工业化生产中果蔬热处理温度，尽量在最短的时间内最大限度地钝化酶的活性，尽可能对产品质量产生最小的影响。

在50～70℃的温度下，处理10min后，雪花梨PPO还能保留50%的活性，80℃处理10min后能保留30%的活性，90℃处理4min就能灭掉90%的酶活，但是再继续加热处理，酶活保留率变化很小（图4），所以90℃处理4min是最佳的灭酶条件。许多文献也都报道了其他果蔬中PPO的热稳定性：枇杷PPO在85℃处理2.5min，酶活保留率仅为5%［11］；桑 果 PPO 在80 ℃ 处 理10min，酶 活 保 留 率 为10%［12］。和其它果蔬中PPO相比，雪花梨PPO的热稳定性更强，因此，在加热灭酶这一环节，在雪花梨加工过程中需要更高的热处理温度或更长的处理时间。

图4 赵州雪梨PPO的热稳定性Figure 4 Thermal stability of PPO in Zhaozhou snow pear

2.5 酶反应动力学研究

对底物浓度与雪花梨PPO活性关系的研究结果表明该酶催化反应复合米氏方程曲线，可以由米氏方程表示。根据试验数据利用双倒数作图法作出Lineweaver－Burk曲线，如图5所示。

图5 雪花梨PPO酶促反应的双倒数曲线Figure 5 Lineweaver－Burk plot of PPO in Zhaozhou snow pear

由图5可以求出Vmax＝ 437U/min，Km＝0.015 6mM，进而得出酶反应动力学的米氏方程（1）。

从Km值可以看出来酶对底物的亲和性，Km值越小对底物的亲和力越强。

3 结论

本试验研究表明，赵州雪花梨PPO最适pH 7.0，最适温度30℃，在90℃条件下处理4min可有效钝化PPO活性。在加工过程中控制pH和温度可以有效的防止褐变的发生。酶反应动力学中，在以邻苯二酚为底物时，Vmax＝437 U/min，米氏常数Km＝0.0156mM。

1 汪立祥，孙彬.徽州雪梨资源及开发利用［J］.中国林副特产，2007，12（6）：83～84.

2 姜峥，苏政波，马闯，等.雪梨发酵酒的加工工艺研究［J］.山东食品发酵，2007（2）：16～20.

3 纪花，陈锦屏.梨汁酶褐变控制方法研究［J］.食品工业，2007（2）：17～18.

4 杨光宇，牟德华.果蔬汁多酚氧化酶酶促褐变机理及其控制研究进展［J］.饮料工业，2009（8）：4～6.

5 Rocha A M C N，Morais A M M B.Characterization of polyphenoloxidase（PPO）extracted from‘Jonagored’apple［J］.Food Control，2001（12）：85～90.

6 宗亦臣，贵禧，冯双庆.枣果实多酚氧化酶性质的研究［J］.林业科学，2003，39（3）：45～47.

7 Estrella Nu′1ez－Delicado，Marta Serrano－Megē′as，Antonio Jose′Pe′rez－Lo′pez，et al.Characterization of polyphenol oxidase from Napoleon grape［J］.Food Chemistry，2007（100）：108～114.

8 连毅，乔旭光，李燕，等.大蒜多酚氧化酶特性的研究［J］.食品科学，2007，28（11）：290～293.

9 徐芹，乔勇进，方强，等.砀山酥梨多酚氧化酶酶学特性及抑制效应的研究［J］.食品科学，2008，29（4）：74～77.

10 张福平，张喜春.佛手瓜多酚氧化酶酶学特性研究［J］.食品科学，2010，31（1）：161～164.

11 Chang－Kui Ding，Yoshinori Ueda，Yoshihiro Imahori.Purification and Properties of Polyphenol Oxidase from Loquat Fruit［J］.J.Agric.Food Chem，1998，46（10）：4 144～4 149.

12 Oktay Arslan，Mahmut Erzengin，Selma Sinan，et al.Purification of mulberry（Morus alba L.）polyphenol oxidase by affinity chromatography and investigation of its kinetic and electrophoretic properties［J］.Food Chemistry，2004（88）：479～484.

Enzymatic characteristics of polyphenol oxidase in Zhaozhou snow pear

YANG Guang－yu1MOU De－hua1ZHAO Guang－xi2GE Na3WAN Qing1

（1.Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang，Hebei050018，China；2.Qinhuangdao City Institute of Products Quality Supervision and Inspection，Qinhuangdao，Hebei066000，China；3.Qinhuangdao Entry－Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qinhuangdao，Hebei066004，China）

Zhaozhou snow pear as the material，enzymatic characteristics of polyphenol oxidase（PPO）was studied in this paper.The results showed that the optimum pH for the pear PPO was 7.0and the optimum temperature was 25 ℃ with catechol as substrate.There was a positive correlation between the consistency of substrate and the enzyme activity，which would be inactivated after treated in 90℃for 4min.The research of enzymatic reaction kinetics showed the best activity toward catechol wasVmax＝ 437U/min，Km＝0.015 6mM.

Zhaozhou snow pear；polyphenol oxidase；enzymatic characteristics

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.003

杨光宇（1984－），男，河北科技大学在读硕士研究生。E－mail：yangguangyu1984＠vip.qq.com

牟德华

2010－06－10