影响壳聚糖固定化谷氨酸脱羧酶的因素

姜启兴何 莎张 可于沛沛夏文水

（1.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2.空军航空医学研究所，北京 100142）

影响壳聚糖固定化谷氨酸脱羧酶的因素

姜启兴1何 莎1张 可2于沛沛1夏文水1

（1.江南大学食品学院，江苏 无锡 214122；2.空军航空医学研究所，北京 100142）

以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，制备固定化谷氨酸脱羧酶（GAD），并研究固定化反应中各个因素对固定化GAD活力的影响。结果表明，壳聚糖固定化谷氨酸脱羧酶的最佳条件为：戊二醛质量分数3%，处理时间16～24h，处理温度40℃，酶吸附温度4℃、酶吸附时间24h以上，给酶量为70.8mg/g壳聚糖。

壳聚糖；谷氨酸脱羧酶；固定化

γ－氨基丁酸简称GABA，又名4－氨基丁酸、氨酪酸，是脑内重要的抑制性物质，对哺乳动物心血管活动有着重要的调节作用［1］。谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）是生物法富集生产GABA的关键酶。目前，发达国家如日本主要利用微生物发酵产生GAD进而生产GABA，中国也有相关研究报道，但目前微生物法生产GAD的成本普遍较高。近年来，中国有很多研究者利用植物中的GAD生产GABA并取得了较好的结果［2－4］：张晖等研究表明利用廉价易得的米糠制备GABA是有效可行的；同时，为了提高米糠中GAD酶的稳定性和提高米糠的利用率，对米糠进行固定化也进行了研究。

壳聚糖是一种多功能的生物材料，被广泛用作固定化酶、亲和层析、金属鳌合亲和层析的载体［5－6］。本试验直接从米糠中提取GAD粗酶，以壳聚糖为载体、戊二醛为交联剂，对影响壳聚糖固定化谷氨酸脱羧酶的因素进行研究，为进一步优化米糠生产GABA工艺提供依据。

1 材料与方法

1.1 原料与设备

壳聚糖：脱乙酰度85%，济南海得贝海洋生物工程有限公司；

巯基乙醇：98%，Janssen Chimica公司；

25%戊二醛水溶液、磷酸吡哆醛、丙三醇、冰醋酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氢氧化钠等：均为分析纯，中国医药（集团）上海化学试剂公司；

电子天平：AB104－N，梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司；

分光光度计：722型，上海精密科学仪器厂；

电热恒温水浴锅：HH－2，常州国华电器有限公司；

电热鼓风干燥箱：101－A，通州市制药设备厂；

冷冻离心机：4K－15，德国Sigma公司；

微型漩涡混合仪：WH－2，上海沪西分析仪器厂有限公司；磁力搅拌器：79－Ⅰ型，江苏江阴科研器械厂；

循环水式多用真空泵：SHB－B95型，郑州长城科工贸有限公司；

多功能食品加工机：SQ2119，上海帅佳电子科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 GAD粗酶提取液的制备 取细米糠200g，加入提取液 1 000mL（50mmol/L 磷 酸 钾 缓 冲 液，pH 5.6，2mmol/L 巯基乙醇，2mmol/L EDTA，1mmol/L PLP和体积分数10%的甘油），用高速分散器打成匀浆，6层纱布过滤，4℃下离心10min（12 000r/min），离心2次。上清液即为GAD粗酶提取液，粗酶提取液活力为2.5U/mL。

1.2.2 固定化GAD的制备 称取适量珠状壳聚糖，加入一定浓度的戊二醛水溶液20g，磁力搅拌均匀，一定温度下静置过夜，用pH 5.6的磷酸钾缓冲液抽洗至滤液中检测不到戊二醛存在（230nm下检测无吸收峰），然后加入20mL粗酶提取液（于细米糠中提取所得），搅拌均匀后在一定温度下静置过夜，用pH 5.6的缓冲液抽洗至滤液中检测不到蛋白质存在（茚三酮反应无色），即得固定化GAD。

1.2.3 固定化GAD与游离GAD酶活测定 用测定GABA生成量的方法计算酶活力。以1.0%L－谷氨酸溶液为底物（用pH 5.6PBS缓冲液配制），加入一定量的GAD粗酶提取液或固定化GAD于40℃水浴中保温2h，取酶反应液0.4mL，加入 Na2CO3（1mol/L）0.1mL、pH 10.0硼酸盐缓冲液（0.2mol/L）0.5mL、6% 苯酚1mL，混匀，于室温下（20℃）5min内加入5.2%NaClO溶液1mL，混匀后放置4～8min，然后沸水浴10min，立即冰浴20min，待溶液出现蓝绿色后，加入2.0mL 60% 乙醇溶液，混匀后测定640nm处的吸收值。

根据测得的吸光度，结合GABA标准曲线，对应到其质量浓度上，换算成相应的质量，除以GABA的分子量（103.12），再除以参与反应的粗酶液中蛋白质质量或固定化GAD质量，以每克酶每30min生成1μmol GABA作为一个酶活力单位U。固定化GAD酶活回收率按式（1）计算：

1.2.4 固定化酶工艺

（1）戊二醛浓度对固定化GAD酶活回收率的影响：称取适量珠状壳聚糖，分别加入20g 0.25%，0.5%，1.0%，2.0%，3.0%，5.0%，7.0%的戊二醛水溶液，磁力搅拌均匀，4℃冰箱中静置过夜，用pH 5.6的缓冲液抽洗至滤液中无戊二醛存在（230nm下检测无吸收峰），然后加入20mL粗酶提取液，搅拌均匀后于4℃冰箱中静置过夜，用pH 5.6的缓冲液抽洗至滤液中无蛋白质存在（茚三酮反应无色），即得固定化GAD。分别测定所得固定化GAD的酶活回收率，比较分析戊二醛质量分数对固定化GAD酶活回收率的影响。

（2）戊二醛交联时间对固定化GAD酶活回收率的影响：称取适量珠状壳聚糖，加入20g 3%的戊二醛水溶液，磁力搅拌均匀，4℃冰箱中分别静置4，8，12，16，20，24，48h，其他步骤同1.2.4（1）。

（3）戊二醛处理温度对固定化GAD酶活回收率的影响：称取适量珠状壳聚糖，加入20g 3%的戊二醛水溶液，磁力搅拌均匀，分别于4，25，40，50℃下保温静置16h，其他步骤同1.2.4（1）。

（4）酶固定温度对固定化GAD酶活回收率的影响：称取适量珠状壳聚糖，加入20g 3%的戊二醛水溶液，磁力搅拌均匀，4℃冰箱中静置16h，用pH 5.6的缓冲液抽洗至滤液中无戊二醛存在（230nm下检测无吸收峰），然后加入20mL粗酶提取液，搅拌均匀后分别于4，25，30，35，40℃水浴中静置过夜，其他步骤同1.2.4（1）。

（5）酶固定时间对固定化GAD酶活回收率的影响：称取适量珠状壳聚糖，加入20g 3%的戊二醛水溶液，磁力搅拌均匀，4℃冰箱中静置16h，用pH 5.6的缓冲液抽洗至滤液中无戊二醛存在（230nm下检测无吸收峰），然后加入20mL粗酶提取液，搅拌均匀后分别在4℃冰箱中静置8，12，18，24，32，48h，其他步骤同1.2.4（1）。

（6）粗酶液用量（蛋白质用量）与壳聚糖用量之比对固定化 GAD酶活回收率的影响：分别称取1，5，7，8，10，12g珠状壳聚糖，其他步骤同1.2.4（1）。

2 结果与讨论

2.1 GABA的标准曲线

测定的GABA回归方程为y＝0.295x＋0.010，R2＝0.996 0。标准曲线见图1。

图1 GABA标准曲线Figure 1 Standard curve of GABA

2.2 戊二醛浓度对固定化GAD酶活回收率的影响

由于戊二醛既是交联剂，又是酶的变性剂，因此在制备固定化GAD反应过程中，戊二醛的用量对固定化酶的活力具有显著的影响。在其他条件不变的情况下，改变戊二醛用量，制备固定化GAD，测定其相对活力，得到不同戊二醛质量分数对固定化GAD酶活回收率影响的关系图（见图2）。

图2 戊二醛浓度对固定化GAD酶活回收率的影响Figure 2 Effect of glutaraldehyde concentration on recovery rate of immobilized GAD enzyme activity

由图2可知，随着戊二醛浓度的增加，酶活回收率呈先增后减的趋势。当戊二醛浓度低于3%时，固定化GAD的酶活回收率随戊二醛浓度的增加而上升，这是因为随着戊二醛浓度的增加，与壳聚糖氨基结合的醛基数量增加，相应固定化GAD的量也逐渐增加，因而酶活力也增加。戊二醛浓度超过3%时，由于壳聚糖结合过多的活性醛基，导致酶活性中心受到过多的醛基进攻，使酶失活，固定化GAD的活力下降。因此，采用质量分数3%的戊二醛溶液制得的固定化GAD效果最好，此时酶活回收率达11.93%。

2.3 戊二醛交联时间对固定化GAD酶活回收率的影响

戊二醛交联时间对固定化GAD酶活回收率的影响见图3。由图3可知，随着交联时间的增加，固定化GAD的活力先迅速增加后又缓慢降低最后趋于平缓。戊二醛交联时间在16～24h范围内，得到的固定化GAD酶活回收率都在11%以上。这主要是由于交联时间越长，与壳聚糖交联的戊二醛的量越多，固定化的酶量也越多，因而酶活越高。而继续延长交联时间，壳聚糖结合过多的戊二醛，酶活性中心受到过多的醛基进攻，使酶失活，固定化GAD的活力稍有下降。故最适交联时间为16h，此时酶活回收率为11.96%。

图3 戊二醛交联时间对固定化GAD酶活回收率的影响Figure 3 Effect of glutaraldehyde crosslinking time on recovery rate of immobilized GAD enzyme activity

2.4 戊二醛处理温度对固定化GAD酶活回收率的影响

戊二醛处理温度对固定化GAD酶活回收率的影响见图4。

图4 戊二醛处理温度对固定化GAD酶活回收率的影响Figure 4 Effect of glutaraldehyde processing temperature on recovery rate of immobilized GAD enzyme activity

由图4可知，随着温度的升高，固定化GAD的酶活回收率呈先增后减的趋势，处理温度为40℃左右时制得的固定化GAD酶活回收率最大，为15.36%，而在4℃时的酶活回收率最低。这可能是由于戊二醛与壳聚糖反应时伴随着能量变化，在40℃比较有利于该反应。因此，戊二醛交联壳聚糖的最适温度为40℃左右。

2.5 酶固定温度对固定化GAD酶活回收率的影响

GAD非常容易失活，酶的固定化温度直接影响了固定化酶的酶活回收率。酶固定温度对固定化GAD酶活回收率的影响见图5。

图5 酶固定温度对固定化GAD酶活回收率的影响Figure 5 Effect of immobilization temperature on recovery rate of immobilized GAD enzyme activity

由图5可知，随着处理温度的升高，其酶活回收率迅速降低；4℃冰箱中处理得到的固定化GAD酶活回收率最大，为12.22%；40℃时则基本失活。这主要是由于在较高的温度下，游离GAD很快失活，而在低温下GAD的酶活得到较好的保持，并经固定化后提高了其稳定性。因此，酶固定化的最适温度为4℃。

2.6 酶固定时间对固定化GAD酶活回收率的影响

酶固定时间对固定化GAD酶活回收率的影响见图6。

图6 酶固定时间对固定化GAD酶活回收率的影响Figure 6 Effect of immobilization time on recovery rate of immobilized GAD enzyme activity

由图6可知，随着酶固定时间的延长，固定化GAD的酶活回收率也随之不断增加。当酶吸附时间在24h以上时，其酶活回收率都在16%以上，但随着时间延长，酶活回收率的增长趋势减缓。这是由于时间越长，壳聚糖上固定的酶越多，因此固定化GAD的酶活回收率也越高。

2.7 给酶量对固定化GAD酶活回收率的影响

给酶量对固定化GAD酶活回收率的影响见图7。

图7 给酶量对固定化GAD酶活回收率的影响Figure 7 Effect of enzyme concentration on recovery rate of immobilized GAD enzyme activity

由图7可知，固定化GAD的活力，最初随给酶量增加而升高，随后又迅速降低，当每克壳聚糖载体固定蛋白质的量为70.8mg时，固定化GAD的活力最大，其酶活回收率达到22.38%。

3 结论与展望

本研究以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，利用壳聚糖微球制备固定化的GAD。研究发现，戊二醛浓度、戊二醛处理时间、戊二醛处理温度、酶吸附温度、酶吸附时间及给酶量等因素均能显著影响GAD的固定化；壳聚糖微球与戊二醛交联的最佳工艺条件为：戊二醛浓度3%，戊二醛处理时间16～24h，戊二醛处理温度40℃；固定化酶的最佳条件为：酶吸附温度4℃，酶吸附时间24h以上，给酶量70.8mg/g壳聚糖，酶活回收率达到22.38%。

本试验中固定化所用的GAD为提取的粗酶液，粗酶液中含有可溶性糖、盐、杂蛋白等杂质，对固定化的干扰较大，另外GAD本身稳定性较差，极易失活，从而导致本试验的酶活回收率相对较低。因此今后研究中应将GAD初步分离纯化后再进行固定化，同时应考虑GAD的活性保护措施；另外本试验过程中未考虑壳聚糖的脱乙酰度、相对分子量、pH等因素的影响。通过对上述因素深入研究有望进一步提高固定化GAD的酶活回收率。

1 王来仪.γ－氨基丁酸、受体药理学及对心血管活动的调节［J］.心血管学报，1991，10（1）：46～49.

2 陈颖，沈艳，姚惠源.米糠γ－氨基丁酸富集工艺的研究［J］.粮食与饲料工业，2005（4）：5～7.

3 张晖.米胚谷氨酸脱羧酶性质及其富集γ－氨基丁酸研究［D］.无锡：江南大学，2004.

4 王筱婧，王立，马晓博，等.利用海藻酸钠固定化米糠制备γ－氨基丁酸的研究［J］.食品工业科技，2009，30（4）：222～224.

5 陈星河，曾超，米运宏，等.壳聚糖在固定化GAD载体上的应用［J］.广西轻工业，2007（8）：18～19，31.

6 林少琴，吴若红.壳聚糖固定谷氨酸脱梭酶的研究［J］.药物生物技术，2005，12（2）：101～105.

Effect of factors on chitosan immobilized glutamate decarboxylase

JIANG Qi－xing1HE Sha1ZHANG Ke2YU Pei－pei1XIAW en－shui1

（1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi，Jiangsu214122，China；2.Instute of Aviation Medicine Air Force，Beijing100142，China）

Glutamate decarboxylase（GAD）in rice bran was immobilized with chitosan using glutaraldehyde as crosslinking agent.The influence of each factor in the immobilization was studied on the activity of immobilized GAD.The results show that the best condition of immobilization of glutamate decarboxylase with chitosan were：3%glutaraldehyde solution，processing time for 16～24h，treatment temperature is 40 ℃，enzyme adsorption temperature is 4 ℃，enzyme adsorption time over 24h，amount to enzyme to chitosan 70.8mg/g.

chitosan；glutamate decarboxylase（GAD）；immobilization

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.005

江南大学食品学院青年博士基金课题（编号：FS－200810）

姜启兴（1977－），男，江南大学讲师，博士研究生。E－mail：qixingj＠163.com

夏文水

2010－05－21