纤维素酶高产菌的筛选和鉴定

魏亚琴邵建宁麻和平张文齐

杨 勇3刘彩云1赵昊星1慕婷婷1

（1.甘肃省科学院，甘肃 兰州 730000；2.兰州大学生命科学学院，甘肃 兰州 730000；3.南开大学生命科学院，天津 300071）

纤维素酶高产菌的筛选和鉴定

魏亚琴1，2邵建宁1麻和平1张文齐1

杨 勇3刘彩云1赵昊星1慕婷婷1

（1.甘肃省科学院，甘肃 兰州 730000；2.兰州大学生命科学学院，甘肃 兰州 730000；3.南开大学生命科学院，天津 300071）

从兰州榆中县兴隆山国家自然保护区采集土样，先用羧甲基纤维素钠刚果红培养基筛选出79株Hc值较大的产纤维素酶菌株，再经液体发酵复筛测CMC酶活和滤纸酶活。结果表明，经复筛后菌株No－15A的纤维素酶活力最高，羧甲基纤维素酶活1 376.20U/mL，滤纸酶活497.78U/mL，其粗酶液分解滤纸快速明显，且该菌株生长速度最快，每日菌落直径增长量为4～5cm。经形态学初步鉴定菌株No－15A属青霉。

纤维素酶；羧甲基纤维素酶活；滤纸酶活；青霉

纤维素是自然界分布最广泛、最丰富、最廉价的多糖物质，是植物细胞壁主要成分［1］，也是地球上年产量最大，具有巨大潜力的可再生天然资源。据估计，纤维素生成量每年高达1 000多亿t，中国每年农作物秸秆总产量为7亿多t，仅农业生产中形成的农作物残渣，如稻草、玉米秸、麦秸，每年就5亿t之多［2］，目前这些资源大部分通过简单焚烧，在浪费能源的同时也对环境造成污染。随着石油、煤炭、天然气等不可再生资源日渐耗竭，有效转化，科学利用数量极其庞大的纤维素资源具有广阔的前景［3］。利用纤维素酶水解纤维素成葡萄糖并进一步发酵转化成燃料乙醇、SCP饲料蛋白和各种平台化合物等，对缓解全球能源危机、饲料资源和化工原料紧张，保护环境等均具有重大意义［4］。

纤维素酶是一组降解纤维素生成葡萄糖的复杂酶系，完整的纤维素酶系由3类酶组成：内切β－1，4－葡聚糖酶，它作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解1，4－糖苷键，产生大量有非还原端的小分子纤维素；外切β－1，4－葡聚糖酶，它主要作用于纤维素线状分子末端，水解β－1，4－糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子；β－葡萄糖苷酶，它的作用是水解纤维二糖及低分子量的纤维寡糖生成葡萄糖［5］。3种酶必须比例合理，才能很好地发挥协同降解纤维素的作用。

从自然界筛选纤维素酶高产菌是构建高效纤维素分解技术的基础性工作［6］。甘肃省兰州榆中县境内的兴隆山森林覆盖率高、雨水充沛、气候温凉湿润，形成了极其丰富的微生物资源。本试验拟从兴隆山森林土壤中分离筛选出产纤维素酶活较高的菌株，以便进一步研究开发利用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

羧甲基纤维素钠：天津市凯通化学试剂有限公司；

吐温－80：天津市凯通化学试剂有限公司；

新华1号滤纸：兰州化学物理研究所；

硝基水杨酸试剂：天津市凯通化学试剂有限公司；

分光光度计：721型，武汉迈新医疗设备有限公司；

光学显微镜：AQ－2010C，上海光学仪器厂。

1.2 培养基

1.2.1 羧甲基纤维素钠培养基 羧甲基纤维素钠5g，K2HPO41g，NaNO33g，KCL 0.5g，MgSO40.5g，FeSO40.01g，琼脂17g，蒸馏水1 000mL。pH值5.5～6.0。

1.2.2 斜面活化保藏培养基 去皮马铃薯200g，麦芽糖20g，琼脂15g，蒸馏水1 000mL。pH自然。

1.2.3 液体发酵产酶培养基 微晶纤维素粉10g，麸皮10g，（NH4）2SO43g，MgSO40.4g，CaCl2 0.4g，KH2PO41g，吐温－801mL，酵母膏 0.5g，蛋白胨 2g，蒸馏水1000mL。pH自然。培养基均在0.11MPa，121 ℃，灭菌30min备用。

1.3 方法

1.3.1 样品采集 在兴隆山次生林区采集距表层5cm处的潮湿腐质土壤、枯叶、腐烂朽木等。

1.3.2 菌株的初筛 称取样品适量，剪碎研磨后加入100mL灭菌生理盐水，并带玻璃珠的三角瓶中充分振摇均匀，稍静置后取上清液用无菌生理水稀释后涂布到初筛培养基表面，即羧甲基纤维素钠培养基，28℃培养4～5d后，往长菌平板中加入适量1mg/mL刚果红溶液，染色1h，弃去染液后，加入适量1mol/L的NaCl溶液洗涤，挑选产水解圈直径与菌落直径比值Hc较大的菌落于初筛培养基划线分离纯化后接入斜面活化保藏培养基。

1.3.3 菌株的复筛 将初筛获得的菌株制备浓度为107个/mL的孢子悬液，取4mL接种于内装40mL液体发酵产酶培养基［7］的容积为250mL的三角瓶中。旋转式摇床220r/min培养，发酵48h前30℃，48h后28℃，发酵第6天检测酶活，筛选出CMC酶活和滤纸酶活均较高的菌株。

1.3.4 酶活测定 采用DNS法测定CMC酶活和滤纸酶活［8］。CMC酶活和滤纸酶活单位定义是：以CMCNa或新华滤纸为底物，在pH 4.8，50℃，1mL酶液1min水解底物生成1μg葡萄糖为1个酶活单位，以U表示。

1.3.5 纤维素酶高产菌生长速度及形态学鉴定 初筛和复筛筛选出CMC酶活和滤纸酶活同时较高的菌株。将其接种到马铃薯琼脂培养基，28～30℃培养，连续观察平板上菌株从开始生长到产大量孢子过程中菌落生长状况，测量菌落每日直径增长量，计算菌落生长速度。观察菌落颜色、大小、边缘和表面质地、纹饰、渗出物、气味及菌落在平板正反面颜色，培养基颜色，菌丝长势、生长密度，产孢时间、孢子颜色及每日产孢量变化等。

丝状真菌制片［9］：载片中央滴加一小滴乳酸石炭酸溶液，然后用接种针从菌落边缘挑取少许菌丝体和孢子置于其中摊开，低倍镜和高倍镜下观察菌丝、分生孢子梗、分生孢子链、分生孢子等形态。

形态学鉴定：观察菌落形态，镜检菌丝及分生孢子梗、孢子链、孢子形态，并结合《真菌鉴定手册》［10］，将菌株相应特征与检索表中对比，进行被选菌株形态学的初步分类。

2 结果与分析

2.1 菌株的初筛

土样稀释液涂布于羧甲基纤维素钠培养基平板表面，培养至第6天用刚果红染色法观察水解圈，有200多个菌落周围产生了清晰水解圈，有真菌、细菌、放线菌。菌落有透明、粉红、乳白、墨绿、青绿、灰绿、黄绿、黄褐、桔黄、灰白、黑色等。从中挑选了水解圈与菌落直径比值Hc较大的纤维素酶产生菌确定为初选菌株。形态观察初选菌株以真菌为主，还有较多细菌和个别放线菌，真菌中以霉菌为主。见图1。

图1 菌株No－15A在羧甲基纤维素钠平板上产生的水解圈Figure 1 Transparent circle on CMCNa culture medium of the strain No－15A

2.2 菌株的复筛

初选菌株发酵产酶后，测其粗酶液的酶活，测3次取平均值。以酶活值为复筛标准筛选出CMC酶活和滤纸酶活同时较高的15株，且其形态以霉菌为主。由表1可知，No－15A的菌株酶活最高，其 CMC酶活1 376.2U/mL，FPA酶活497.78U/mL。由图2可知，菌株 No－15A 的稀释粗酶液0.5mL与50mg滤纸条于pH 4.8，反应1h后，稀释粗酶液对滤纸条分解效果明显。

2.3 纤维素酶高产菌生长速度及形态学鉴定

将菌株No－15A接种于PDA培养基，恒温箱28℃培养，生长十分迅速，接种培养基第1天开始长出菌落，并在培养基上迅速扩散；第2天菌落直径达5～6cm，菌丝浓密粗壮，交联状态好，有横隔，且极易产生分生孢子；第3天菌落直径达9～10cm，菌落长满覆盖整个培养皿，且产孢量多。菌株生长速度是：每日直径增长量为（4±0.5）cm。将菌株No－15A接种在PDA，恒温箱30℃培养，菌落长势依然旺盛，菌落每日直径增长略大（4±0.5）cm，生长速度稍快。经与其它14株菌生长形态及菌落直径大小做对比可知：菌株No－15A的生长速度最快。

表1 纤维素酶产生菌酶活Table 1 Enzyme activity of the cellulase－producing strains

图2 菌株No－15A粗酶液分解滤纸条Figure 2 Decomposition for filter paper strip of the strain No－15A’s cellulase

菌株No－15A在PDA培养基上菌落呈毡状，质地致密厚实，与培养基连接紧密；菌落有特殊香味；菌落转色快，正面淡灰绿色，外围有较窄白色菌丝圈带；菌落背面淡茶褐色至黄褐色；并随培养时间逐渐加深；菌丝有横隔膜，细胞中有细胞核；分生孢子梗从菌丝垂直生出集成束状，其顶端有一至多次分枝呈扫帚状，扫帚枝最后一级分枝是产生分生孢子的小梗，每一小梗顶端着生成串分生孢子，分生孢子串呈不分枝链状；孢子椭圆形，光滑，呈青绿色。据菌落形态和镜检结果初步鉴定菌株No－15A是真菌门，半知菌亚门，丝孢纲，从梗孢目，丛梗孢科，从梗孢科单胞亚科，曲霉族，青霉属（Penicillium）。见图3和图4。

图3 菌株No－15A的菌落形态Figure 3 Colony morphology of the strain No－15A

图4 镜检菌株No－15A的菌丝和分生孢子形态Figure 4 Mycelium and conidiospore morphology of the strain No－15Aby microscope

3 结论

（1）采用羧甲基纤维素钠刚果红方法筛选纤维素酶产生菌，虽然较繁琐，但它是一种有效的筛选方法。

（2）兴隆山森林土壤中蕴含着多种可有效分解纤维素的微生物，其中真菌占大多数。

（3）筛选得到的纤维素酶高产菌株No－15A，经形态学初步鉴定为青霉属，其酶活最高，生长十分迅速，值得进一步研究。今后将继续通过理化诱变或发酵产酶条件的优化进一步提高菌株No－15A的CMC酶活和滤纸酶活，为工业应用提供纤维素酶高产菌优质菌株。

1 封晔，来航线，郑真.高产纤维素酶菌株的筛选及其产酶条件研究［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2007，35（10）：133～138.

2 侯进慧，刘全德，高明侠.胡萝卜表面产纤维素酶细菌初步鉴定分析［J］.食品科学，2010，31（5）：233～236.

3 朱涛.一株丝状真菌胞外中性纤维素酶系的分离纯化与酶功能的研究［D］.济南：山东大学，2008.

4 肖舸，雷芳，喻东，等.一株产纤维素酶绿色木霉的筛选及发酵条件优化［J］.四川大学学报（自然科学版），2004，41（2）：422～425.

5 Qin Zhang，Chi－Ming Lo，Lu－Kwang Ju.Factors affecting foaming behavior in cellulose fermentation byTrichoderma reeseiRutC－30［J］.Bioresourcetechnology，2007，98（4）：753～760.

6 Zhou XG，Smith Joseph A，Oi Faith M，et al.Correlation of cellulose gene expression and cellulolytic activity throughout the gut of the termite reticulitermes flavipes［J］.Gene，2007，395（12）：29～39.

7 陈文祥.产纤维素酶放线菌的筛选及其产酶条件与酶学性质初探［D］.成都：四川师范大学，2007.

8 李忠玲.产碱性纤维素酶放线菌的筛选及其产酶条件与酶学性质初步研究［D］.西安：西北大学，2008.

9 钱存柔，黄仪秀.微生物学实验教程［M］.北京：北京大学出版社，1999.

10 魏景超.真菌鉴定手册［M］.上海：科学技术出版社，1979.

Screening and identification of a high－yield cellulase strain

WEI Ya－qin1，2SHAO Jian－ning1MA He－ping1ZHANGWen－qi1

YANG Yong3LIU Cai－yun1ZHAO Hao－xing1MU Ting－ting1

（1.Gansu Science Acdemics，Lanzhou，Gansu730000，China；2.Life school of lanzhou university，Lanzhou，Gansu730000，China；3.College of Life Sciences，Nankai University，Tianjin300071，China）

The Xinglong Mountain in Yuzhong county of Lanzhou is a national nature reserve.Soil samples were collected from the forest area at the Xinglong Mountain.These samples were firstly screened by CMCNa Congo Red culture medium，and 79cellulase－producing strains were selected with larger Hc value.And then，these cellulase－producing strains were fermented and CMCase activity and FPA were measured.The experiment results show the activity of the strain No－15Awas highest.Its FPA activity was 497.78U/mL，and CMCase activity was 1376.20U/mL.The enzyme solution of the strain No－15Amade filter paper rotten very fast，and it’s colony growed more quickly than the other 14strains，the colony diameter increased a day is 4～5cm.according to the morphology characteristics，the strain No－15AisPenicillium.

cellulase；CMCase activity；FPA；Penicillium

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.05.006

甘肃省科技计划资助（编号：1010RJZA169）

魏亚琴（1974－），女，甘肃省科学院工程师，硕士。E－mail：weiyq04＠lzu.cn

2010－05－20