一株可利用二甲基巯基丙酸内盐生长的北极海洋细菌的分类鉴定及表型特征分析

张义和 曾胤新 曲江勇

(1烟台大学生命科学学院, 烟台264003;2中国极地研究中心, 上海200136)

提要 二甲基巯基丙酸内盐(DMSP)是一种主要由海洋浮游植物生成的含硫化合物, 在海洋中含量丰富, 同时也是海洋细菌的重要营养物之一。采用生长选择性培养基从北极王湾海水中分离到一株细菌DMSP-1。基于16S rRNA基因序列及基因组平均核苷酸一致性(Average Nucleotide Identity, ANI)分析, 将该菌鉴定为乳酸假单胞菌。该菌细胞呈杆状, 有极生鞭毛; 具有耐冷(可在5℃较快生长, 适宜生长温度范围为22～29℃,最高生长温度为38℃)、耐盐(适宜生长盐度范围为0～4% NaCl、最高生长盐度为8% NaCl)等特性, 表明该菌能较好地适应其所处的北极近岸环境。碳源生长实验证实该菌能以DMSP为唯一碳源进行生长。该菌具有乳酸假单胞菌的许多生理生化特征, 但也存在差异, 如色氨酸脱氨酶与脲酶为阳性、不能利用鼠李糖产酸等。对假单胞菌DMSP-1开展进一步的研究, 将推动人们对于海洋细菌降解DMSP的代谢机制及其在北极海洋环境中生态功能的深入认识。

0 引言

二甲基巯基丙酸内盐(Dimethylsulfoniopropionate, DMSP)是一种在全球海洋中含量丰富的含硫化合物[1-2]。海洋浮游植物每年产生的DMSP可达10亿吨或更多[3]。一些海洋细菌也能合成该物质[4]。DMSP可作为浮游植物的胞内渗透调节剂、抗氧化剂、冷冻保护剂或捕食者威慑物而发挥重要的生理生态作用[1,2,5], 同时也是海洋浮游细菌的重要营养物之一, 可被细菌分解利用[4]。释放到海水中的DMSP, 大部分经由细菌的脱甲基途径生成3-甲基硫代丙酸甲酯(MMPA)、再经过一系列分解代谢, 最后以含硫蛋白形式进入微生物食物网[6-7]。还有部分DMSP, 可被海洋细菌裂解生成二甲基硫(DMS)与丙烯酸盐或3-羟基丙酸辅酶A(3HP-CoA)[8-9]。海洋中大约30%的DMSP 被分解产生DMS, 而由微生物参与所产生的DMS占据了海洋DMS总产量的 90%以上[5,10]。作为海水中最重要的还原态挥发性生源有机硫化物, DMS在表层海水中处于高度过饱和状态, 能够以很大的通量穿过海-气界面进入大气[11], 成为从海洋排放到大气当中含量最为丰富的含硫化合物。DMS进入大气后, 经氧化形成硫酸盐气溶胶, 成为酸雨的重要贡献者[12]。此外, 这些气溶胶容易吸收水分, 可以充当云的凝结核并形成更多的云层, 通过反射或散射太阳辐射使地球表面温度降低[11], 对气候产生冷却效应[13,14], 因此DMS又被称为气候活性气体[15]。细菌在海洋环境中DMSP介导的硫循环中扮演着举足轻重的角色。

有关DMSP降解酶及其产生菌多样性的研究,目前已有大量报道。DMSP脱甲基途径中参与第一步反应的关键酶基因dmdA包含了A～E五个支系[16], 其产生菌分布在α-变形细菌中的玫瑰杆菌、红螺菌目、SAR11、SAR116, 以及γ-变形细菌中的OM60等类群中[17], 并且以玫瑰杆菌、SAR11为主。此外, 研究人员已发现7种参与DMSP降解途径的Ddd酶(DMSP依赖型产DMS裂解酶), 分别由dddD、dddK、dddL、dddP、dddQ、dddY及dddW等基因编码[18-19], 其产生菌分布于变形细菌门的各亚纲以及真菌的子囊菌纲[20]。但相关研究工作大多集中在中、低纬度海域, 对于涉及南、北极高纬度低温海域中的研究报道相对很少。

北冰洋与南大洋, 是大气DMS的巨大的源,并且对全球硫的收支具有显著贡献[21], 生存在这些海域中的浮游细菌, 必然在全球的硫循环中具有重要的生态学意义。在北极王湾, 涉及脱甲基途径的dmdA基因与涉及裂解途径的dddL和dddP基因, 其产生菌都与玫瑰杆菌支系密切相关[22]。而在南极长城站近岸海域, 水体中的dmdA基因均来自玫瑰杆菌支系, 但dddP基因分别来自以Methylobacterium为代表的α-变形细菌以及以Pseudomonas为代表的γ-变形细菌[23]。这些结果表明了不同极地海域中DMSP分解代谢细菌组成的多样性。2010年课题组采用含5mM DMSP的寡营养海盐(Sigma)培养基从北极王湾海水中分离得到菌株DMSP-1。本文通过16S rRNA基因序列分析及基因组比对分析、菌落形态及细胞形态观测、结合生理生化特征检测, 对该菌株进行了分类鉴定及表型特征分析。同时, 采用唯一碳源生长检测方法, 验证该菌能否以DMSP为唯一碳源生长。相关结果将有助于人们进一步认识该DMSP降解菌株的环境适应性, 以及该菌在北极海洋环境中的生态功能, 尤其是对它参与硫循环的认识。

1 材料与方法

1.1 菌种

菌株DMSP-1系由本课题组从2010年7月采集的北极王湾30m水深海水、采用含5mM DMSP的寡营养海盐(Sigma)培养基, 经过8℃避光培养30天后分离获得。现保藏在中国极地研究中心。

1.2 培养基

LB培养基(美国BD公司)。

M9-碳源培养基: 5×M9盐溶液(Na2HPO4·7H2O 12.8 g, KH2PO43g, NaCl 0.5g, NH4Cl 1g, 调pH值至6.9～7.1, 再定容至200 mL)40 mL, 1M MgSO4溶液0.4 mL, 1M CaCl2溶液0.02 mL, 3%NaCl 160 mL,碳源(0.4%葡萄糖溶液, 或10mM DMSP溶液)。

不同碳源(母液): 分别为20%葡萄糖溶液;1M DMSP溶液。

1.3 细菌分子鉴定

采用TaKaRa MiniBEST细菌基因组DNA抽提试剂盒抽提菌株DMSP-1的DNA。采用通用细菌引物27F与1492R扩增细菌16S rRNA基因序列[24-25]。PCR产物经纯化回收、连接、转化及阳性克隆筛选[26], 克隆片段送上海生工生物工程有限公司测序。所得16S rRNA基因序列应用EzTaxon服务器(http://www.eztaxon.org)进行比对以确定与菌株DMSP-1亲缘关系最近的模式菌株,再利用BLAST工具在NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行同源性匹配以获取亲缘序列, 最后选择同属、不同种的模式菌的16S rRNA基因、采用MEGA 5.05(https://www.megasoftware.net)基于邻接法进行系统发育分析并构建系统发育树, 确定细菌DMSP-1在属水平上的分类学位置。

1.4 基因组测序及比对

利用Illumina Miseq测序平台以及PacBio RS II三代测序平台对该菌进行全基因组测序, 相关测序工作委托上海派森诺生物科技股份有限公司实施。获得的基因组大小为6.28Mb, G+C含量为60.01 mol%, 编码基因区占整个基因组86.97%,测序深度为583×。基于平均核苷酸一致性(Average Nucleotide Identity, ANI)计算器(http://jspecies.ribohost.com/jspeciesws/#anib)比较细菌DMSP-1基因组与同属亲缘模式菌基因组的平均核苷酸一致性(ANIb), 从而确定该菌在种水平上的分类学地位。通常ANIb值高于95%时可判定为同一个种[27]。

1.5 菌落及细胞形态

菌株DMSP-1于LB平板上在15℃下培养3 d后, 观察平板上的菌落形态, 记录菌落的颜色、透明度、边缘情况及表面情况。

细菌于2mL LB液体培养基中在15℃下培养36 h后, 送广东省微生物研究所进行透射电镜细胞观测。负染主要步骤为: 吸取样品滴于铜网上, 3 min后用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体; 滴加3%磷钨酸(pH7.0)于铜网上, 3 min后用滤纸从铜网边缘吸去多余染液; 滴加纯水于铜网上, 再用滤纸从铜网边缘吸取多余水,待干后即可用于电镜观察。所用透射电镜为Hitachi H-7650。

1.6 生理生化特征检测

1.6.1 适宜生长温度及最高生长温度

将50 μL新鲜的DMSP-1菌液涂布于LB平板上, 分别置于5、15、25、35、36、37、38、39和40℃下培养24 h后, 观察菌落生长情况; 再将5 μL DMSP-1菌液接种于5 mL LB培养基中, 分别于15、25和35℃下培养48 h(每隔12 h测定菌悬液OD540值), 了解该菌的适宜生长温度范围及最高生长温度。然后将8 μL DMSP-1菌液接种于800 μL LB培养基中, 分别置于18～35℃(间隔1℃)培养24 h后, 于波长540 nm处测定菌悬液浓度以检测菌株生长状况, 从而确定菌株的最适生长温度。

1.6.2 适宜生长盐度及最高生长盐度

将5μL 新鲜DMSP-1菌液分别加入到含不同NaCl浓度(0～10%)的5mL LB液体培养基中, 在25℃摇床中培养, 每日观察其生长状况, 并在波长540 nm处测定菌悬液浓度。

1.6.3 DMSP利用生长实验

将8μL DMSP-1菌液接种于800 μL以DMSP为碳源的M9培养基中, 于25℃混匀器中培养,每日检测其生长状况, 检测该菌是否能以DMSP为碳源进行生长。同时, 以含葡萄糖为碳源的M9培养基作为对照。

1.6.4 生理生化

分别采用API 20NE、API 20E和API ZYM试剂条(法国梅里埃公司)对DMSP-1进行生理生化检测。培养温度为25 ℃, 培养时间为48 h。具体操作按试剂条说明书进行。

1.7 基因登录号

菌株DMSP-1在GenBank的16S rRNA基因序列登录号为KU233521, 基因组登录号为CP034425。

2 结果

2.1 菌株DMSP-1的分类鉴定

获得的菌株DMSP-1的16S rRNA基因片段长度为1498bp, 与模式菌Pseudomonas lactisWS 4992T的序列同源性达99.72%。通过与假单胞菌属已知模式菌的系统发育比对分析(图1), 可以确定菌株DMSP-1属于假单胞菌属。

进一步比较菌株DMSP-1的基因组与模式菌Pseudomonas lactisWS 4992T的ANIb值, 发现该值为95.66%(大于95%的阈值), 因此可将菌株DMSP-1鉴定为乳酸假单胞菌(Pseudomonas lactis)。此外, 菌株DMSP-1的G+C含量与模式菌P.lactisWS 4992T(60.0 mol%[28])也是一致的。

2.2 菌株DMSP-1的菌落及细胞形态

在LB平板上培养, 菌株DMSP-1的菌落呈圆形, 湿润有光泽, 边缘平整, 表面光滑并呈米黄色(图2)。透射电镜相片(图3)显示, 该菌的细胞呈杆状, 无芽孢, 有极性鞭毛。

图2 菌株DMSP-1在LB平板上的菌落照片Fig.2.Colonies of strain DMSP-1 growing on LB agar plate

图3 菌株DMSP-1的负染细胞透射电镜照片Fig.3.Transmission electron micrograph of negatively stained cells of strain DMSP-1

2.3 菌株DMSP-1的生长特征

2.3.1 生长温度及生长盐度

平板培养结果显示, 该菌在5℃培养6 d, 有明显肉眼可见的细小菌落生成; 在15℃培养2 d, 即有明显细小菌落生成; 在25℃、35℃培养仅1 d, 即可生成密集菌落, 且菌落形态较大(但在35℃中长出的菌落要小于25℃中的)。液体培养结果也显示, 菌株DMSP-1在25℃时生长情况优于35℃时(图4、图5);当培养温度达到或超过39℃, 菌株DMSP-1无法生长。但将培养平板重新置于25℃环境中, 菌株可恢复生长, 但长出的菌落细小, 这说明超过菌株最高生长温度的高温会抑制该菌的生长、并可能对菌株造成一定程度的损伤。液体培养结果表明(图5), 菌株DMSP-1在22～29℃的温度范围内生长最为适宜(OD540吸光度值均高于0.68)。菌株DMSP-1能在5℃低温条件下较快生长, 最适生长温度超过15℃、但最高生长温度低于40℃, 参考Morita[29]及Jay[30]对于耐冷菌(psychrotolerant bacteria)的定义, 可以将菌株DMSP-1划归为耐冷菌范畴。

图4 菌株DMSP-1在不同温度下培养48 h的生长情况Fig.4.Growth of strain DMSP-1 under different temperatures for 48 h

图5 菌株DMSP-1在不同温度下培养24 h的生长情况Fig.5.Growth of strain DMSP-1 under different temperatures for 24 h

盐度实验显示, 该菌在0～4% NaCl条件下培养1 d即可生成浑浊菌液(OD540大于1.0), 表明这一盐度范围适合菌体的生长(图6)。最适生长盐度为1% NaCl。在5%～6% NaCl中培养2 d, 该菌也可生成浑浊菌液; 而在7%、8% NaCl中分别培养3d、5d后才可生成肉眼可见的明显菌液; 在盐度达到或超过9% NaCl时, 该菌无法生长(培养7d)。这表明DMSP-1在高盐浓度下有一个逐渐适应环境后再生长的过程, 但当盐度条件超过其自身调节适应能力, 该菌则无法生长。根据该菌耐受一定浓度的盐、但生长不依赖于盐的特性, 可以将该菌归为耐盐菌, 表明其能较好地适应淡水及海洋水生环境。

图6 菌株DMSP-1在不同盐度下培养24 h的生长情况Fig.6.Cell growth of strain DMSP-1 in different sodium chloride concentration for 24 h

2.3.2 DMSP利用生长实验

结果显示, 培养1d后, 即可观测到DMSP-1在以葡萄糖作为碳源的M9培养基中有明显生长现象(图7); 而在以DMSP为碳源的M9培养基中培养4d后才有肉眼可见的生长现象。这一方面表明该菌以葡萄糖为碳源的生长状况明显优于以DMSP为碳源, 另一方面也证实该菌的确能够利用DMSP作为碳源进行生长。

图7 菌株DMSP-1的碳源利用生长情况Fig.7.Cell growth of strain DMSP-1 based on different carbon source

2.4 菌株DMSP-1的生理生化特征

革兰氏试纸片检测结果显示, 菌株DMSP-1为革兰氏阴性菌。基于API 20E、20NE及ZYM试剂条的分析结果显示, 该菌β-葡萄糖苷酶、碱性磷酸盐酶、酯酶(C4), 类脂酯酶(C8)、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和酸性磷酸酶为阳性, 类脂酶(C14)、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶呈微弱阳性, 可同化癸酸、苹果酸和柠檬酸。该菌的许多生理生化特征与同种模式菌P.lactisWS 4992T是相似或一致的(表1), 例如, 氧化酶、过氧化氢酶、明胶酶、精氨酸双水解酶为阳性, β-半乳糖苷酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、吲哚反应、硝酸盐/亚硝酸盐还原反应为阴性, 都不产H2S。此外, 菌株DMSP-1与P.lactisWS 4992T在细胞形态、生长温度及盐度、以及基因型等方面也存在不少相近之处(表1)。但同时, 两者之间也存在一些差异,如菌株DMSP-1的脲酶、色氨酸脱氨酶为阳性,VP(Voges-Proskauer)反应也为阳性, 而P.lactisWS 4992T均呈阴性; 菌株DMSP-1不能利用鼠李糖产酸, 而P.lactisWS 4992T则相反。

表1 菌株DMSP-1与模式菌Pseudomonas lactis WS 4992T的表型及基因型特征比较Table 2.Comparison of phenotypic and genotypic characteristics between strain DMSP-1 and type strain Pseudomonas lactis WS 4992T

3 讨论

位于北极斯匹次卑尔根群岛上新奥尔松地区的王湾(79°N, 12°E)及其邻近海域, 是北冰洋水团和大西洋水团的交汇区, 受极地海冰、大西洋暖水团和北极冷水团的多重影响[31]。王湾具有典型的北极峡湾生境, 海湾深度从湾外向湾内逐渐变浅,从湾外的360 m逐渐减少到湾内的大约60 m。湾内水文状况和季节变化较为复杂[32-33]: 北大西洋海流的一个分支——西斯匹次卑尔根海流为该地区的沿岸带来了高温、高盐的海水(温度高于3℃, 盐度高于34.9 PSU), 大西洋和北极水团在陆架区内的交换导致了王湾水温和盐度的变化; 同时湾内海冰的形成和消融、以及夏季大量冰川融水的注入均影响着湾内的水文状况。本研究中分离到的菌株DMSP-1, 具有较宽的生长温度(最高生长温度38℃)及生长盐度(0～8% NaCl)范围, 反映出该菌能很好地适应王湾复杂多变的温度与盐度环境, 从而能发挥出一定的生态学作用。

假单胞菌属(Pseudomonas)成员众多, 据2015年8月原核生物名录(List of prokaryotic names with standing in nomenclature, LPSN)公布,该属包括223个种和 18 个亚种, 还有数10个种待确认[34]。假单胞菌广泛存在于土壤、淡水、河海水等环境中, 多数假单胞菌的分布是全球性的。他们生化能力活泼, 其活性在有机物质矿化方面具有重要的意义。绝大多数假单胞菌, 营养要求低, 代谢类型多, 在一个简单的有机化合物作为唯一碳源和能源的无机培养基中就能生长,从而使该类菌能够适应不同的环境[35]。所有的假单胞菌在中性和碱性的环境(pH为7.0～8.5)中都可生长, 大多数不能在pH为6及以下的环境中生长,海生种还需要至少1% NaCl才生长, 这反映出它们需要特殊的钠或渗透压, 或两者都需要[36]。淡水或土壤种则没有明确的离子和渗透压的需要[36]。本研究中的菌株DMSP-1在0～4% NaCl条件下生长迅速、并且能够耐受8% NaCl的盐度,由此推测, 该菌可能来源于陆生环境, 但能够很好地适应海洋环境。通过表型(如细胞形态、生理生化特征)、基因型(如16S rRNA基因、G+C含量)以及基因组ANI值比较, 菌株DMSP-1被鉴定为乳酸假单胞菌(Pseudomonas lactis)。该菌与乳酸假单胞菌模式菌WS4992T在细胞形态、菌落形态、生理生化特征、G+C含量、以及基因组等方面具有大量的相似之处(表1), 但DMSP-1比模式菌WS4992T更耐盐、生长上限温度也更高。乳酸假单胞菌WS4992T分离自牛生乳, 能在0～6%NaCl环境中生长, 最高生长温度为35℃[28]。这些结果也支持了关于菌株DMSP-1来源于陆生环境的推测。同样是来源于低温海洋环境, 王志娟等[37]报道了从南极磷虾虾肉分离到一株产低温淀粉酶的乳酸假单胞菌, 但由于该菌株的鉴定过程缺乏与亲缘模式菌的DNA杂交值或基因组ANI值, 因此尚不能断定该菌株确为乳酸假单胞菌。鉴于菌株DMSP-1分离自北极峡湾海水, 具有耐冷、耐盐特性, 而与该菌同种的模式菌WS4992T分离自牛乳、生长不耐盐, 因此菌株DMSP-1对于研究乳酸假单胞菌的生物地理分布、系统发育进化、环境适应性等无疑将会是一个有意思的材料。

通过对与珊瑚有关的细菌的研究, Raina等[38]推断出绝大多数DMSP降解细菌属于以假单胞菌等为代表的γ-变形细菌, 其中的假单胞菌属成员含有DMSP代谢基因。赵丽军[39]采用以DMSP为唯一碳源的培养基, 从东海和黄海海水中分离到假单胞菌。同样以DMSP为唯一碳源, Curson等[40]从大西洋鲱鱼肠道中分离到假单胞菌, 发现它们具有dddD基因并且能将DMSP分解产生DMS。基于宏基因组方法对黄海、渤海沉积物的研究显示, DMSP裂解酶DddP是以假单胞菌和中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)为主[41]。这些研究结果表明, 假单胞菌属成员在海洋环境中DMSP的分解代谢中发挥着作用。

Archer等[42]在王湾开展的研究结果显示, 水体酸化可导致以Heterocapsa rotundata为代表的甲藻在内的浮游植物丰度升高, 从而导致DMSP产量的升高。但DMS的释放并未有明显增加, 这可能一部分归因于细菌生物量的升高从而需要更多的含硫蛋白用于自身合成并促使更多的DMSP进入脱甲基途径[42]。在热带及温带水域的研究表明, 当硫需求得到满足后, 细菌对DMSP的代谢才会从脱甲基向裂解途径转换[43-44]。本课题组在王湾夏季的研究结果显示, 该水域脱甲基酶基因dmdA的丰度高于裂解酶基因dddP的丰度, 表明该水域DMSP的分解代谢可能主要与脱甲基途径有关[22,45]。课题组在分离自王湾海水的假单胞菌中检测到dmdA基因片段[46], 表明该属细菌可能通过脱甲基途径参与了王湾水域DMSP的分解代谢。而在本研究中的菌株DMSP-1中, 并未检测到dmdA基因。虽然前期在菌株DMSP-1中检测到dddP基因[22], 但在后续研究中却未能再扩增到该基因, 在基因组中也未找到该基因片段。原因不详。此外, 课题组在该菌基因组中也未比对到任何与目前已知DMSP降解途径的各个酶基因相关的序列。而在本文中, 碳源生长实验证实菌株DMSP-1的确能够以DMSP作为唯一碳源进行生长。因此, 对于该菌是否具有新型DMSP降解酶类值得开展进一步的深入研究工作, 例如可考虑将基因组与转录组分析结合以寻找该菌株参与DMSP分解代谢的相关酶基因。相关工作无疑将进一步增进人们对于假单胞菌参与北极海洋生态系统中硫循环的认识。