温度对原料乳中分离的耐冷菌产胞外酶的影响

夏永军， 张 峰， 宋 馨， 王光强， 艾连中， 熊智强

上海理工大学健康科学与工程学院，上海食品微生物工程技术研究中心，上海 200093

耐冷菌在原料乳低温贮藏、加工运输过程中广泛存在。原料乳作为乳制品生产的基本原料，在加工的不同阶段，其耐冷菌的群落结构各不相同，例如未巴氏杀菌阶段以假单胞菌等耐冷菌为主[1]。原料乳在灌装和低温储存过程中最常发生耐冷菌大量污染，而机器上冷凝水和灌装机不清洁也易造成污染[2]。原奶的快速冷却和冷藏有利于原料乳中耐冷菌的生长，在巴氏杀菌前原料乳中耐冷菌生长可达到较高的数量，使牛奶产生异味。尽管非孢子形态的耐冷菌可通过巴氏杀菌杀死，但其产生的蛋白酶、脂肪酶和磷脂酶等胞外酶能耐受巴氏杀菌甚至超高温瞬时杀菌的温度[3]，仍可以水解牛奶中的蛋白质、脂肪和卵磷脂等营养物质，导致牛奶产生腐臭、酸败或肥皂味、苦味、奶油味等不良风味，导致产品品质显著下降，严重影响乳制品的货架期。

本课题组前期采用变性梯度凝胶电泳和高通量测序分析婴幼儿配方奶粉生产过程中细菌群落结构变化和分布，发现原料乳阶段主要的微生物污染为假单胞菌属，而奶粉产品中主要菌群为乳球菌属、链球菌属、栖热菌属、不动杆菌属和拟杆菌属[4]。为探索原料乳中耐冷菌及其产胞外酶规律，本研究从原料乳样品中筛选30株耐冷菌，进行16S rRNA菌种和耐热蛋白酶aprX基因鉴定，分析温度对其产胞外酶酶规律的影响，为原料乳质量控制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品

原料乳取样自光明乳业股份有限公司，4 ℃冰箱放置4 d后在4 ℃低温培养条件下分离筛选耐冷菌。

1.2 培养基

LB培养基：胰蛋白栋10 g，酵母浸膏5 g，氯化钠10 g，调节pH 7.2，去离子水定容至1 L。

LA培养基：胰蛋白胨10 g，酵母浸膏2.5 g，葡萄糖1 g，脱脂粉1 g，去离子水定容至1 L。

1.3 耐冷菌的分离

参照辛亮报道的方法[5]，采用LB和LA培养基对原料乳样品在4 ℃低温培养条件下进行耐冷菌的分离。

1.4 耐冷菌16S rRNA和耐热蛋白酶AprX基因的鉴定

将筛选出的耐冷菌分离纯化后进行菌落PCR，采用XIONG等报道的PCR反应体系和程序条件[6]。引物SM2F(AAATCGATAGCTTCAGCCAT)和SM3R(TTGAGGTTGATCTTCTGGTT)用于鉴定耐热蛋白酶AprX基因特异性引物[7]，引物27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1 492R(CTACGGCTACCTTGTTACGA)用于鉴定16S rRNA基因特异性引物[8]。PCR产物送至华大基因有限公司进行测序，获得的序列在NCBI nr数据库中进行Blast同源比对，确定耐冷菌的种类及AprX基因信息。

1.5 耐冷菌蛋白酶和脂肪酶酶活测定及其热稳定性

将活化的耐冷菌2%接种分别接种在LA和LB培养基中，25 ℃培养2 d， 4 ℃ 8 000×g离心20 min，取上清分别采用国标GB/T 23527—2009和GB/T 23535—2009测定胞外蛋白酶和脂肪酶酶活，上清90 ℃处理5 min测定酶活的热稳定性。

1.6 耐冷菌产酶能力的测定

耐冷菌菌株在15 mL UHT乳中采用4 ℃、25 ℃和37 ℃下分别培养5 d，取4 mL采用1.5中的方法测定蛋白酶和脂肪酶酶活。取1 mL发酵液在0.9%生理盐水中梯度稀释后，在平板上进行菌落计数。

1.7 数据统计

上述各实验均重复3次，实验数据用均值±标准差表示。

2 结果与讨论

2.1 原料乳中耐冷菌的分离鉴定

为探究原料乳加工阶段中耐冷菌的影响，本研究利用LB和LA培养基从原料乳样品中分离出30株在4 ℃下能生长的耐冷菌，菌株命名为Z1-Z15和P1-P15。对此30株耐冷菌进行菌种鉴定，16S rRNA测序比对发现，除P5为芽孢杆菌，其余29株都为假单胞菌(表1)，表明原料乳中耐冷菌主要为假单胞菌。XIONG 等[4]采用DGGE和高通量测序发现原料乳中微生物主要菌群为假单胞菌，与本研究的实验结果一致。

大量研究报道假单胞菌能产生多种耐热蛋白酶，其中标志性蛋白酶是AprX[9-11]，其保守结构域碱基序列长度为850 bp。本实验选取分离的耐冷菌，采用特异性引物鉴定基因组中是否含有aprX基因。PCR结果表明Z1，Z2，Z3，Z5，Z6，Z7，Z8，Z9，Z10，Z11，Z12，Z13和Z15共13株耐冷菌含有aprX(表1)。MARCHAND S等[12]从牛奶中筛选的55株假单胞菌中，42株检测到aprX基因。这些结果均表明原料乳中较多的假单胞菌都含有aprX基因。基于此， DUFOUR D等[10]提出aprX基因可以用做检测牛奶是否受到假单胞菌污染，但不能用来评估对牛奶影响的危害程度，且该基因在不同菌株中的表达水平也不一致。

表1 耐冷菌16S rRNA和耐热蛋白酶AprX基因的鉴定

2.2 耐冷菌胞外脂肪酶和蛋白酶的热稳定性

为研究分离的耐冷菌所产胞外酶的热稳定性，对发酵液上清进行90 ℃加热处理5 min后，大部分菌株所产胞外脂肪酶的酶活比40 ℃处理进一步提升(图1A), 尤其是Z8、Z14、P4、P5和P8胞外脂肪酶活性提高1.88、2.20、2.00、2.25和3.67倍，表明原料乳中耐冷菌产生的脂肪酶具有很好的耐热性，经过巴氏杀菌后仍然会对牛奶中的脂肪产生很大的破坏，产生酸败。多数耐冷菌菌株所产胞外蛋白酶70 ℃处理比40 ℃处理的酶活更高，而P11、P15和Z7菌株在90℃处理后胞外蛋白酶的酶活也比40 ℃处理分别提高1.89、1.81和2.11倍(图1B)，表明耐冷菌不但能够分泌耐热蛋白酶，而且热处理能激活蛋白酶的活性。POFFÉ R等[13]从53份散装牛奶样品中分离出143株耐冷菌，其分泌的蛋白酶热稳定性好，在80 ℃、90 ℃和100 ℃处理下蛋白酶的活性都增加，只有在55 ℃处理1 h和140 ℃处理2 min后酶活才下降。牛奶通常是巴氏杀菌，90 ℃处理5 min已高于普通巴氏杀菌处理条件，说明原料乳中如果存在耐冷菌，它们能够产生的耐热的蛋白酶和脂肪酶等胞外酶，能耐受巴氏杀菌而不影响其酶活，进而可影响乳品品质。

A：脂肪酶的酶活及热稳定性；B：蛋白酶的酶活及热稳定性图1 耐冷菌的胞外酶热稳定性研究

2.3 不同温度下耐冷菌的产酶能力

为研究耐冷菌在不同温度下的产酶能力，本实验在4 ℃、25 ℃和37 ℃培养条件下测定耐冷菌胞外蛋白酶的酶活(图2)。4 ℃时Z9表现具有较好的蛋白酶活性，25 ℃所有耐冷菌数量达到峰值，而37 ℃蛋白酶活显著增加。KARLSSON MA等[14]研究也发现夏季环境温度升高会导致较高的贮藏温度，耐冷菌数量也随之增加。大部分耐冷菌特别是Z3在37 ℃表现出很高的活性(图2C)，这可能是牛奶在37 ℃更易变质的原因。MENG L等[15]研究表明大多数耐冷菌2 ℃水解活性低于4 ℃、7 ℃和10 ℃，但也存在部分假单胞菌在2 ℃储藏后具有更高的水解活性，表明培养温度对酶活的影响与菌株特性相关，例如荧光假单胞菌产酶的最适产酶温度为22 ℃，其次为7 ℃和32 ℃[16]。

在4 ℃、25 ℃和37 ℃培养条件下测定耐冷菌胞外脂肪酶的酶活(图3)，25 ℃脂肪酶的产量要高于4 ℃和37 ℃，且25 ℃会有更多菌株产脂肪酶，表明低温和高温培养能有效降低产胞外脂肪酶的耐冷菌数量。不同菌株对温度的敏感性具有显著差异，Z11在4 ℃和25 ℃具有较高的脂肪酶活性，而在37 ℃则没有检测出脂肪酶活性。Z15在低温下会产生脂肪酶，37 ℃却没有检测出酶活，表明较高培养温度能抑制其脂肪酶的产生。

A：4 ℃；B：25 ℃；C：37 ℃图3 不同温度下耐冷菌产胞外脂肪酶能力

3 结论

从原料乳中共筛选出30株耐冷菌，包括29株假单胞菌和1株芽孢杆菌，表明假单胞菌在原料乳中的耐冷菌占据主导地位。耐冷菌所产胞外蛋白酶和脂肪酶具有较好的热稳定性，特别是Z8、Z14、P4、P5和P8菌株所产脂肪酶和P11、P15和Z7菌株所产蛋白酶热处理后酶活显著增强，均提高1.8倍以上；分离的耐冷菌在4 ℃培养条件下能抑制耐冷菌的蛋白酶产生，而37 ℃培养条件下对脂肪酶产生影响较大，表明温度对耐冷菌产胞外酶有明显影响，且较低和较高的培养温度能够抑制耐冷菌的产酶能力。