蔓越莓及蔓越莓制品体外抑菌试验的测定与分析

张 波， 张莉敏， 张荣桂

1.枣庄市市场监管综合服务中心，山东 枣庄 277000；2.枣庄市食品药品检验检测中心，山东 枣庄 277000

蔓越莓又称蔓越橘，是杜鹃花科越橘属的常绿小灌木矮蔓藤植物，主要生长在北半球的凉爽地带酸性泥炭土壤中[1]。果实为长2 cm～5 cm 的卵圆形浆果，吃起来有重酸发涩的口感[2]。蔓越莓的种植主要集中在美国北部，我国黑龙江地区也有种植蔓越莓。但现在全球90%以上的蔓越莓产品仍在北美出售和消费[3]。国内外学者对蔓越莓成分及功能研究很多，如蔓越莓含大量的维生素C(Vc), Vc的含量为普通水果的6倍，具有抗氧化[4]、预防血小管疾病[5]、促进机体生长发育、预防坏血病[6]、降血压、预防尿道感染[7]、降低龋齿[8]、牙周炎发生率[9]、抑制胃幽门螺杆菌[10]等功能。国内外报道的多为蔓越莓汁、蔓越莓提取物、蔓越莓压片糖果、蔓越莓蜜饯等制剂的预防疾病功效及抑菌性概述或研究进展之类的文章[11]，国内少见有对蔓越莓及制品进行体外抑菌效力检测的试验科研报告。本研究选取了细菌以大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、副伤寒沙门氏菌、枯草芽孢杆菌为试验菌，真菌以白色念珠菌、黑曲霉为试验菌，厌氧菌以生孢梭菌为例，对蔓越莓浆果、蔓越莓干、蔓越莓提取物、蔓越莓蜜饯进行体外抑菌效力检测研究，为蔓越莓的保健预防疾病功能提供理论依据。

1 材料、仪器及方法

1.1 材料

A、蔓越莓浆果(储存日期：20211022，北京市通州兴贸三街冷运库)； B、蔓越莓干(20211112,枣庄市食品药品检验检测中心自制 )；C、蔓越莓提取物(100 g/袋，含花青素25%，批号：20211125，汉中汉溯源生物科技有限公司)；D、蔓越莓蜜饯(批号： 20210921；山东德宝食品有限公司)；E、蔓越莓蜜饯(批号：20210907.11 B，山东省枣庄市大润发超市)。

1.2 仪器

PGL3002电子天平，艾德姆衡器(武汉)有限公司；DHP9082电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；LRH150电热恒温培养箱，上海一恒科技有限公司；GR60DF立式压力灭菌器，致微(厦门)仪器有限公司；80系列离心沉淀器，上海手术器械厂；ALN-50S菌落计数器，上海昂尼仪器仪表有限公司；Sevenmulti酸度计，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；XW80A混合器，上海医科大学仪器厂；YT-761匀浆仪，杭州盈天科学仪器有限公司。上述仪器均在检定有效期内。

1.3 方法

1.3.1试验菌种 大肠埃希氏菌(批号：201209,Escherichiacoli,缩写：Eco)；铜绿假单胞菌(批号：201117,Pseudomonasaeruginosa, 缩写：Pae)；乙型副伤寒沙门氏菌(批号：201212,SalmonellaparatyphiB, 缩写：Spa)；金黄色葡萄球菌(批号：201229,Staphylococcusaureus, 缩写：Sau)；枯草芽孢杆菌(批号：201016,Bacillussubtilis, 缩写：BSu)；生孢梭菌(批号：201030,Clostridiumsporogenes, 缩写：Csp)；白色念珠菌(批号：201226,Candidaalbicans, 缩写：Cal)；黑曲霉(批号：201203,Aspergillusniger, 缩写：Ani)。以上8种试验菌均购自北京三药科技开发公司，均通过中国医学细菌保藏管理中心(CMCC)溯源检查。以下文中内容菌种名称均用英文缩写。

1.3.2培养基 营养琼脂(批号：200807)；胰酪蛋白胨琼脂(批号：200709，缩写TSA)；沙氏葡萄糖琼脂(批号：210609，缩写SDA)；生产厂家均为北京陆桥技术股份有限公司。其他材料：0.75% 无菌生理盐水、0.5 mg/L 二氧化氯溶液、无菌平面皿(规格：直径90 mm)、无菌牛津杯(内径6 mm，高10 mm)。

1.3.3各供试品供试液的制备 将各供试品外部清洁消毒，分别称适量，于无菌匀浆罐内粉碎，根据产品的特点，加适量无菌生理盐水将各供试品进行打浆、离心、过滤除菌后[12]，稀释成1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15、1∶30稀释级的溶液(g/mL)，备用。

1.3.4菌悬液的制备 取上述8种试验菌，置于相应培养基中培养，然后用无菌生理盐水稀释制成(1～5×106) CFU/mL浓度的菌悬液备用[13]。

1.3.5抑菌实验 牛津杯法[14],往9 cm的无菌平皿中倾注20 mL灭菌后的不同培养基，凝固后，吸取0.5 mL各试验菌菌悬液置于凝固后的平皿中，均匀涂布，然后平皿中等距放置3个牛津杯，其中1个牛津杯注入1∶2稀释级的各供试品溶液；另一个牛津杯注入无菌生理盐水做空白对照；第三个牛津杯注入0.5 mg/L 二氧化氯溶液(因其具有广谱、高效的杀菌能力[15]，故选择之)为阳性参照物对照；牛津杯放置在培养箱，37 ℃培养24 h，生孢梭菌用营养琼脂，厌氧环境，37 ℃培养24 h，白色念珠菌和黑曲霉用SDA培养基，在25 ℃分别培养72 h，120 h[16]，然后取出平皿测定抑菌圈直径。

1.3.6抑菌圈法测最小抑制浓度(MIC)[17]将1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15、1∶30稀释级供试品溶液同样采用牛津杯法实验，进行抑菌圈直径测定，直到牛津杯周围没有明显的抑菌圈为止，确定最小抑菌浓度。

2 结果与分析

2.1 抑菌效果分析见表1

表1 抑菌效果比较研究*

由表1可知，1∶2稀释级的各供试品对不同的试验菌都有不同程度的抑制作用，蔓越莓提取物对各种试验菌的抑菌能力最强，其次为蔓越莓浆果，蔓越莓干和蔓越莓蜜饯的抑菌作用相对较弱。

2.2 最低抑菌浓度(MIC)，结果见表2

表2 最低抑菌浓度研究比较(以抑菌圈直径表示，mm)

由表2可知，对同种细菌的抑制作用，蔓越莓提取物抑菌效果最强。蔓越莓提取物对大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、乙型副伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌的MIC为1∶15稀释级；对白色念珠菌和黑曲霉的MIC为1∶10稀释级。

2.3 对非洁净区环境空气中微生物的抑菌效果检测

分别取1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15稀释级各供试品溶液0.5 mL,均匀涂布于TSA琼脂、SDA平板的表面，打开平皿盖，暴露非洁净区环境中10 min，TSA琼脂平板置于35 ℃培养24 h，SDA平板25 ℃培养72 h，同时以不加供试品的琼脂平板同法做空白对照实验，观察菌落生长情况，结果见表3。

表3 非洁净区环境菌落数(CFU)

表3表明不同稀释级的各供试品对空气中的微生物也有一定的抑菌性。蔓越莓提取物的抑菌效果最好，其次为蔓越莓浆果。

表格说明① 表1、表2、表3、表4中的A为蔓越莓浆果，B为蔓越莓干，C为蔓越莓提取物，D为蔓越莓蜜饯(20210921)，E为蔓越莓蜜饯(20210907)，F为0.5 mg/L二氧化氯溶液，G为0.75%无菌生理盐水；② 表格里的1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、 1∶10、1∶15、1∶30指的是各供试品稀释倍数，换算成浓度(单位：g/mL)相应为0.5、0.25、0.125、0.166 7、0.1、0.066 7、0.033 3, 四个表格里数值均为3次平行试验的平均值；③ 表1和表2中各抑菌圈直径数值包含牛津杯的直径6 mm。“-”指未测定；表4中测pH的室温为25 ℃，生理盐水为稀释液；④ 表格里的TSA、SDA均为培养基缩写。

3 讨论

在本研究中，蔓越莓提取物对各种试验菌的抑菌能力最强，这可能和它的低pH有关(见表4)。试验测定蔓越莓提取物在1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶15稀释级的pH约为2.3～2.7，同稀释级蔓越莓其他制品pH约为2.4～3.2。据报道，(1) 极低的pH值可以抑制大部分致病菌的生长[18]；(2) 有观点认为A型原花青素是蔓越莓果中的主要抗菌成份，抗菌机制可能为：①A型原花青素与铁离子螯合抑制细菌生长，②阻断其他金属离子的作用影响细菌的代谢，③抑制氧化磷酸化，影响细胞膜的稳定性[19]。也有研究者发现原花青素在体外能有效抑制细菌黏附作用[20]，抗黏附浓度为≥60 μg/mL[21]，从而起到抑菌作用。有作者声称质量优良的100 g蔓越莓浆果中含原花青素约62.7 mg。但原花青素性质不稳定，易被氧化[22]，温度、pH值、光照、糖等外在因素都会对它产生影响[23]。其中温度影响最大[24]，一般情况下，天然色素在低温或干燥状态下较稳定，升温或加热易氧化变色[25]。因此含花青素的食品如果储存、加工方式不当，花青素含量会降低[26]。蔓越莓提取物中纯花青素含量比较高，所以抑菌能力强于其他制品，蔓越莓浆果因未经过加工处理，花青素成分未被破坏，所以抑菌能力也比其他制品强。但从总体上看，蔓越莓提取物及蔓越莓制品对各种试验菌都有不同程度的抑制作用，因此未来蔓越莓也可能成为一种天然的抗菌剂。在我国，有大量的天生带有抑菌能力的特殊植物[27]，随着我国对营养与食品、药品安全的关注度越来越高，人们也越来越倾向于食用天然的、安全的功能型食品或药品。利用蔓越莓的抑菌性，可以将蔓越莓开发成多系列产品，如用作天然防腐剂、天然酸碱调节剂、抗菌药物、保健食品或添加剂等,但仍需要更多的研究验证。

表4 不同稀释级各供试品的pH值

另外，从本次实验可知，在对有过强的酸性、碱性或强抑菌性的食品进行微生物检验时，除了对食品的酸性、碱性进行中和外，也有必要按国家药典委员会规定的方法对食品的抑菌性进行去除[28]，对该类食品的微生物检验方法进行验证实验，以确认所采用的方法适合该产品的微生物计数，这样得到的检验数据才真实准确。