得力劲酒中总黄酮的测定及其应用

周 爽， 王佳艺

上海冠生园华佗酿酒有限公司，上海 200040

《汉书·食货志》中说 “酒，百药之长”，中国古代为治疗疾病在酒中加入药材，制成药酒。经过后世的发展,至今已分类为药品批文的药酒、有保健品批文的保健酒和含有一些药食两用的药材的普通食品露酒。露酒以蒸馏酒、发酵酒或食用酒精为酒基,加入可食用或药食两用(或符合相关规定)的辅料或食品添加剂,进行调配、混合或再加工制成的,是一种已改变了其原酒基风格的饮料酒[1]。露酒的药味没有药酒和保健酒浓烈，口感的愉悦度更好，更合适在多场景饮用。

生物总黄酮是指黄酮类化合物，是一大类天然物质，广泛存在于植物界，是许多中草药中的有效成分。黄酮类化合物有抗炎、抗病毒、强心、镇静和抗氧化、抗衰老、免疫调节和抗肿瘤等作用，具有很强的抗氧化和消除自由基作用。[2]

2022年6月1日实施的GB/T 17204《饮料酒术语和分类》中对露酒的定义为以黄酒、白酒为酒基，加入按照传统即是食品又是中药材或特定食品原辅料或符合相关规定的物质，经浸提和/或复蒸馏等工艺或直接加入从食品中提取的特定成分，制成的具有特定风格的饮料酒[3]，特别提到了中药材，未来的露酒类产品会同时兼顾传统的中医药和中国传统的酒文化方向发展。深度地研究成分、口感也将是露酒质量控制的发展方向。中国劲酒、汾酒、泸州老窖等酒企对旗下的露酒产品中的成分物质多有研究，如中国劲酒的毛铺紫荞酒就在外盒上标出总黄酮含量。

露酒所采用的一些药食两用的药材一般都经过白酒的浸提。为了获得更好的食用愉悦感，同时作为普通食品又没有成分功能的要求，露酒中添加的药材量相对药酒和保健酒较少。本文参照《保健食品检验与评价技术规范》[4]和一些实用性文献[2，5-6]，就露酒中总黄酮的含量情况做了一些研究。检测样品为上海冠生园华佗酒业有限公司生产的露酒——得力劲酒(含有枸杞，茯苓，山药，甘草，大枣，桑椹，玛咖(粉)，益智仁，砂仁，丁香等药材)。同时还对其浸提液中的总黄酮进行了测定。总黄酮的检测方法经验证后，初步设计了浸提工艺实验，然后根据正交表对浸提液中的总黄酮进行了测定，得出最优浸提工艺。

1 仪器和材料

1.1 仪器与设备

UV-2600A型紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；SQP电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司。

1.2 试剂

芦丁标准品(批号：100080-201811)，中国药品生物制品检定所；甲醇，甲苯等均为分析纯，聚酰胺粉(柱层析用，30目～60目)，国药集团。

1.3 材料

得力劲酒第一次浸提液，得力劲酒第二次浸提液，成品得力劲酒。

样品1批号：2022-001；样品2批号：2022-002；样品3 批号：2022-003。

浸提工艺实验样品的药材：枸杞，茯苓，山药，甘草，大枣，桑椹，玛咖(粉)，益智仁，砂仁，丁香。

浸提工艺实验样品的白酒酒基： 40%、50%、60%。

2 方法与结果

2.1 总黄酮检测方法的确认

2.1.1芦丁标准溶液的配制

称取5.0 mg芦丁，加甲醇溶解并定容至100 mL，即得50 μg/mL浓度的芦丁标准溶液。

2.1.2最大波长的确定

取芦丁标准溶液在200 nm～400 nm进行紫外波长扫描寻找最大吸收波长，见图1，在360 nm波长处，芦丁标准溶液的吸光度最高，因此选择360 nm为最大测定波长。

图1 芦丁的紫外光谱图

2.1.3标准曲线的制备

准确吸取50 μg/mL的芦丁标准溶液：0 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL和5.0 mL于10 mL比色管中(含量相当于0 μg、5 μg、10 μg、15 μg、20 μg和25 μg)，用甲醇溶液定容至刻度，摇匀，以甲醇为空白，用1 cm比色皿于波长360 nm处测定吸光度A。以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。求出回归方程为y=0.029 2x+0.001 7，r=0.999 7。标准曲线见图2。

图2 聚酰胺—UV法标准曲线

2.1.4样液制备及测定

试样处理：准确吸取试样1.00 mL于蒸发皿中，加1.00 g聚酰胺粉吸附，转入10 mL层析柱。先用25 mL甲苯洗，甲苯液弃去，然后用甲醇洗脱黄酮，定容至25 mL。甲醇为空白，取待测样液于1 cm比色皿中在波长360 nm处测定吸光度。依据标准曲线，计算试样中总黄酮的含量[2]，见表1和表2。

表1 样品的吸光度

表2 样品总黄酮含量

2.1.5重复性试验

准确吸取1 mL的样品1第一次浸提液，测定其吸光度A，平行测定6次得到的试验重复性，得出样酒中总黄酮含量的标准偏差RSD为2.852%，见表3。

表3 重复性试验结果(n=6)

2.1.6回收率试验

取已测定含量的样品2的第二次浸提液5 mL，其总黄酮含量为2.065 μg/mL, 准确吸取2 mL、3 mL、4 mL浓度为50 μg/mL的芦丁标准溶液分别加入5 mL的浸提液中，加甲醇定容至10 mL，测定回收率。结果见表4。其平均回收率为102.23%，RSD=3.47%(n=6)。

表4 方法回收率试验结果(n=6)

2.1.7稳定性试验

选芦丁标准溶液中的5 μg/mL，15 μg/mL，25 μg/mL作为1#，2#，3#及样品(得力劲酒样品1:2022-001中成品样)测定吸光度后，放置10 min，20 min，30 min，40 min和60 min 后，分别测定其吸光度，由表5可看出，标准溶液及样品在放置20 min，30 min和60 min后，其吸光度的值比较稳定。因此，当有较多样品需要检测时，不会因为放置时间较长而影响检测的准确性。

表5 稳定性试验结果

2.2 浸提工艺实验

2.2.1正交实验因素水平表

根据生产过程中浸提主要涉及三个因素，即浸提液酒精度、搅拌次数、浸提时间。本实验采用正交试验设计试验方案，正交表为L9(33)，以总黄酮的含量作为指标进行正交实验，因素水平表见表6。

表6 正交实验因素水平表

2.2.2正交实验结果

根据正交设计实验方案，用药材和40%、50%、60%的白酒进行2次、3次、4次和12 h、24 h、36 h的浸提实验，测定其总黄酮数据，所得实验结果及数据可见表7和表8。

表7 浸提实验表

表8 极差结果分析

根据表8极差结果分析，C的极差R最大，其次是B，A。极差越大，该因素对总黄酮含量的影响程度越高。因此，在浸提过程中，以总黄酮含量为指标，3个因素对总黄酮含量的主次影响顺序为：C>B>A，即浸提时间>搅拌次数>乙醇浓度。从各因素水平看(K值分析)，A因素为K3>K2>K1，B因素为K3>K2>K1，C因素为K3>K2>K1。由上述分析可以确定最佳浸提工艺条件为A3B3C3，即乙醇浓度为60%，搅拌次数为4次，浸提时间为36 h。

3 分析与结论

根据以上数据，使用聚酰胺UV法检测得力劲酒及浸提液中的总黄酮含量，重复性、稳定性和准确性均符合要求。当然,得力劲酒中的总黄酮物质含量相对于药酒和保健酒较低，但作为日常饮用可以少量补充总黄酮物质，对人体还是有益的。

从数据中还可以看出，第一次浸提液含有较多总黄酮，第二次浸提液总黄酮含量减少，这是由于浸提中使用的白酒体积约占成品体积的20%，说明第一次浸提基本将大部分总黄酮提取出来了，但第二次浸提也是有一定贡献的。最后的工艺决定了成品的总黄酮含量较第一次浸提液也有所减少。

以总黄酮含量作为参考值，开展正交试验对浸提时间、搅拌次数、浸提液浓度三因素进行分析后，发现浸提时间对总黄酮的提取影响最大，同时高浓度提取液对总黄酮的提取优于低浓度，搅拌次数的增加有利于总黄酮的提取。

4 讨论

露酒工艺中的浸提工序是确保浸提物质质量的关键。露酒国标GB/T 27588—2011中对成品有干浸出物的要求，得力劲酒属于动植物类露酒，干浸出物(g/L)≥0.5，对该酒的多年质量跟踪完全可以满足这一要求，但干浸出物无法作为成分指标的依据。本文采用保健食品中总黄酮含量的测定方法——直接紫外法对露酒得力劲酒中的总黄酮的含量进行了测定，并对该方法在得力劲酒中总黄酮的测定的重复性和稳定性进行了验证。

通过对得力劲酒中总黄酮的测定，初步考察了目前该酒的成分情况，为以后深度开发升级产品提供了指标依据。就目前而言，对现有的浸提工艺方法可以进行再组合优化，从时间、浸提酒基、搅拌次数等多方面出发，将总黄酮指标作为参照指标，更科学的为浸提有效成分做合理的工艺设计。同时，为控制产品的稳定性，也可以通过对总黄酮含量的测定，控制浸提过程的质量，以提升和稳定产品的品质。

对总黄酮的测定还有比色法等其他方法，对样品的前处理也有超声波等不同的几种方法，由于中药材本身所含的物质比较复杂，醇提法对中药材里面多数物质都具有较好的提取效果，但是传统的发酵白酒也是含有比较复杂物质成分，因此后面还可以应用不同的方法对得力劲酒中的总黄酮进行测定，不同方法的提取处理和最终数值的差异情况进行比对和分析，从而确定最适合该类露酒的总黄酮测定方法。