分光光度法检测变性淀粉中羟丙基含量的方法的改良

许志骁

上海工微所科技有限公司,上海 200233

羟丙基淀粉取代度测定或含有羟丙基的变性淀粉中羟丙基含量的方法主要有分光光度法[1]，气相色谱法[2]和核磁共振波谱法等[3]。其中，分光光度法实验设备普及率高，实验条件简单，可以成为日常检测的方法。近年常用的试验标准为GB 29930[4]、GB 29931[5]、GB 29933[6]以及去年发布的最新方法GB/T40998—2021[7]。其原理为，淀粉中羟丙基基团在稀硫酸中加热水解为丙二醇，丙二醇与浓硫酸脱水生成丙醛和丙烯醇，该两种物质在浓硫酸介质中与水合茚三酮生成紫色络合物，可在特定波长下测试其吸光度。但该方法在实际运用中因细节不明确、操作差异等原因造成标准曲线线性差、结果重复性低等现象；部分试验条件要求较高，可操作性差，较易造成误操作而形成一定的危害。本文主要针对样品前处理的试验条件、操作细节等进行研究并改良，以期提升实验的可操作性与安全性并获得稳定可靠的实验结果。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品：变性淀粉样品1、样品2、样品3(羟丙基含量按GB/T40998—2021测定为5.2%、3.0%、1.5%)

试剂：1,2-丙二醇(GC)，硫酸(AR)，亚硫酸氢钠(AR)，水合茚三酮(AR)

1.2 仪器与设备

紫外-可见光分光光度计Cary 100；微控数显加热板EH45A；电容恒温水浴锅HH.S11-2S；玻璃液体温度计(0 ℃～200 ℃最小分度值2 ℃)；玻璃液体温度计(0 ℃～100 ℃最小分度值1 ℃)

1.3 试验方法

1.3.1标准曲线的绘制

准确称取1,2-丙二醇0.100 0 g，水定容至100 mL容量瓶中，得1.00 mg/mL储备液。分别准确量取储备液1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL储备液，水定容至100 mL容量瓶中，得10.0 μg/mL、20.0 μg/mL、30.0 μg/mL、40.0 μg/mL、50.0 μg/mL标准曲线溶液。

1.3.2加热水解样品

准确称取0.05 g样品淀粉、空白淀粉于100 mL容量瓶中，加入 25 mL 0.5 mol/L的H2SO4，沸水浴10 min，冷却至室温后加水定容。(完全分解的样液为透明澄清的溶液；空白淀粉为样品淀粉的同源未变性淀粉)。

1.3.3试样混合浓硫酸

取1.00 mL标准曲线溶液、试样液于25 mL具塞试管中，置于10 ℃以下水浴，贴壁滴加8 mL硫酸45 s以上，混匀。

1.3.4浓硫酸混合液加热

混合液混匀后20 ℃水浴1 min，80 ℃～85 ℃水浴10 min，20 ℃水浴1 min。

1.3.5显色剂的加入

试样液置于10 ℃±2 ℃水浴20 min，贴壁滴加水合茚三酮溶液，混匀。

1.3.6显色反应

25 ℃水浴60 min，加硫酸至刻度，颠倒混匀，静置5 min，在30 min内，完成所有同批次试样的吸光度测试。

2 结果与讨论

配制标准溶液30.0 μg/mL丙二醇溶液：取3.00 mL 1.00 mg/mL储备液置于100 mL容量瓶中，加入25 mL 0.5 mol/L的 H2SO4。本文以下无特殊说明，试样液均为30.0 μg/mL丙二醇溶液，以测定平均吸光度最高的试验条件为最佳条件。为控制变量，本文中除当即讨论的实验条件外，其他条件均为GB/T40998—2021中相应条件。

2.1 水解加热时间选择

2.1.1标准溶液水解

由实验原理知丙二醇在浓硫酸中脱水生成丙醛和丙烯醇，而样品水解介质为稀硫酸，如需进行加标回收实验应当验证1,2-丙二醇在稀硫酸中加热水解的情况。试样沸水浴加热，分别在0 min、3 min、5 min、10 min、15 min和20 min水平下测定吸光度。

图1 标准溶液水解

由图1可知，丙二醇在稀硫酸介质中加热0 min～15 min时间范围内，稳定不分解，在加热置20 min时吸光度略微下降。

2.1.2样品淀粉水解

取变性淀粉样品1、样品2和样品3(羟丙基含量5.2%、3.0%、1.5%)及对应空白样品0.05 g置于100 mL容量瓶中，加入25 mL 0.5 mol/L的 H2SO4，沸水浴加热，分别在0 min、3 min、5 min、10 min、12 min、15 min和20 min水平下测定吸光度。

图2 样品淀粉水解

由图2可知，在3 min时部分样品的水解不充分，在5 min～12 min时间范围内吸光度稳定，最高值在10 min，在15 min时吸光度略微下降。综合可知，沸水浴10 min为最佳条件。

2.2 加浓硫酸时间及该步骤冰水浴温度的选择

硫酸的脱水性与温度有关，浓硫酸稀释放热会升高介质温度，此步骤应确保丙二醇脱水成丙醛和丙烯醇的反应不会发生。因此冰水浴温度和滴加硫酸时间具体化有助于实际操作。

2.2.1滴加硫酸时间对吸光度影响

取1.00 mL试样液置于25 mL具塞试管中，在20 ℃水浴中，滴加硫酸(不贴壁)，分别在5 s、10 s、30 s、45 s、60 s和75 s水平下测定吸光度。

图3 滴加硫酸时间对吸光度影响

由图3可知，45 s以上时，吸光度不再上升。

2.2.2贴壁加硫酸时间对吸光度影响

取1 mL试样液置于25 mL具塞试管中，在20 ℃水浴中，贴壁滴加硫酸，分别在5 s、10 s、30 s、45 s、60 s和75 s水平下测定吸光度。

由图4可知，45 s以上时，吸光度不再上升。贴壁加硫酸方式比加滴硫酸方式的吸光度略高。同时可知，20 ℃下，浓硫酸混合试样时的放热，使得一部分丙二醇脱水，在之后加热中损失。

图4 贴壁加硫酸时间对吸光度影响

2.2.3加硫酸时冰水浴温度对吸光度影响

取1 mL试样液置于25 mL具塞试管中，分别在5 ℃、10 ℃、12 ℃、15 ℃、18 ℃和20 ℃水平下，贴壁滴加硫酸45 s以上，测定吸光度。

图5 加硫酸时冰水浴温度对吸光度影响

由图5可知，冰水浴12 ℃以下时，吸光度平稳。

综合可知最佳条件为10 ℃±2 ℃水浴，贴壁滴加硫酸45 s以上。

2.3 脱水反应硫酸浓度的选择

硫酸的脱水性还与浓度有关[8]，本试验选择用新开封的浓硫酸。

取1 mL试样液置于25 mL具塞试管中，贴壁滴加硫酸45 s以上，体积分别为6 mL、7 mL、8 mL、9 mL和10 mL水平下，测试吸光度。

由图6可知，7 mL和8 mL体积时吸光最大且平稳，继续增大体积，吸光度快速下降。由于吸水性[9]存在，浓硫酸浓度开封后缓慢下降，故选择高浓度更佳。最佳条件为8 mL。

图6 脱水反应硫酸体积对吸光度影响

2.4 脱水反应加热条件的选择

根据GB/T40998—2021脱水反应中将内含浓硫酸的玻璃试管两次在冰水浴和沸水浴中切换，容易造成试管爆裂、硫酸喷溅等危险。沸水浴加热需准确控制在3 min，实际实验中，大量试管的准确加热、冷却可操作性不高。在加热前后设置缓冲常温水浴以减少危险性。合理的加热使硫酸脱水丙二醇的反应平稳、均匀发生，提高可操作性。

2.4.1脱水加热前置常温水浴对吸光度影响

将冰水浴中的试管，置于20 ℃水浴，分别在0 s、20 s、30 s、45 s、60 s、75 s和90 s水平下沸水浴3 min，测试吸光度。

图7 脱水加热前置常温水浴对吸光度影响

由图7可知，在60 s水平以下，吸光度平稳。

2.4.2脱水加热后置常温水浴对吸光度影响

沸水浴3 min后，分别将试管置于20 ℃水浴0 s、10 s、20 s、30 s、45 s和60 s水平下，测试吸光度。

由图8可知所有的后置常温水浴时间，都会造成吸光度下降。这是由于冷却速度不够，造成丙醛和丙烯醇的进一步脱水分解，造成损失[10]。

图8 脱水加热后置常温水浴对吸光度影响

2.4.3降低脱水水浴温度及加热时间对吸光度的影响

尝试降低脱水加热的温度，延长加热时间，以降低其敏感度，加强实验的可操作性，降低危险性。将冰水浴中的试管，分别置于40 ℃～45 ℃，50 ℃～55 ℃，60 ℃～65 ℃，70 ℃～75 ℃，80 ℃～85 ℃水浴中，分别加热3 min、5 min、7 min、9 min、10 min、11 min、13 min、15 min和20 min水平下，测试吸光度。

图9 降低脱水水浴温度及加热时间对吸光度的影响

由图9可知，80 ℃～85 ℃水浴9 min～15 min吸光度平稳。加热时间较GB/T40998—2021更宽泛，有效提升实际可操作性。

2.4.4在80 ℃～85 ℃水浴后置常温水浴对吸光度影响

硫酸混合溶液经80 ℃～85 ℃水浴10 min后，分别置于20 ℃水浴30 s、60 s、75 s、90 s水平下，测试吸光度。

由图10可知，在80 ℃～85 ℃水浴后，常温水浴60 s左右，不影响吸光度。

综合可知最佳条件为：20℃水浴60 s，80 ℃～85 ℃水浴10 min，20 ℃水浴60 s后置于冰水浴中。

图10 在80 ℃～85 ℃水浴后置常温水浴对吸光度影响

2.5 添加显色溶液时，冰水浴的温度与时间的选择

温度过高的浓硫酸介质温度除了会进一步脱水丙醛和丙烯醇外，还会分解水合茚三酮[10]，都会造成络合物的减少。应当具体化冷却试样的的温度，但实际实验中直接测量试样温度会损失溶液量，因此应当具体化冷却时间。

2.5.1加显色溶液时混合溶液温度对吸光度影响

将加热后的试管置于5 ℃水浴中，将温度计置于试管中测量硫酸混合液的温度30 s后读数后贴壁加水合茚三酮溶液，分别在混合液温度30 ℃、20 ℃、15 ℃和10 ℃水平下测试吸光度。

图11 加显色溶液时混合溶液温度对吸光度影响

由图11可知，在混合液温度15 ℃及以下时，吸光度平稳。

2.5.2混合液冷却至15 ℃的时间选择

将加热后的试管置于10 ℃±2 ℃水浴中，分别水浴5 min、10 min、15 min、20 min和25 min水平下，用温度计置于试管中30 s，测量混合液温度。

由图12可知，10 ℃±2 ℃水浴20 min以上可将混合液温度降至15 ℃以下。可知10 ℃±2 ℃水浴20 min贴壁滴加水合茚三酮溶液为最佳条件。

图12 混合液冷却至15 ℃的时间选择

2.6 显色水浴时间的选择

不同文献对反应时间的选择不同，按GB/T40998—2021中显色定容后，应准确静置5 min后测定吸光度。实际实验中大量试管准确地在100 min+5 min条件下完成测定的可操作性不高。应当探究合理的反应时间与测定时间段。

将加入显色溶液后的混合液分别在25 ℃水浴40 min、50 min、60 min、70 min、80 min、90 min、100 min、110 min和120 min水平下测试吸光度。

图13 显色水浴时间对吸光度影响

由图13可知，吸光度在70 min时达到最大，60 min～110 min时间内，吸光度保持平稳，120 min后吸光度下降较快。

水浴时间应优化为：25 ℃水浴60 min，加硫酸至刻度，颠倒混匀，静置5 min以上，在40 min内完成同批次所有试样的吸光度检测。

2.7 选择以上最优条件下的改良试验

2.7.1丙二醇标准曲线

式中为丙二醇浓度μg/mL；f为稀释后体积mL，本方法中为100 mL；0.776 3为丙二醇转化羟丙基系数。制作丙二醇标准曲线。

图14 丙二醇标准曲线

由图14可知，在丙二醇浓度在10.0 μg/mL～50.0 μg/mL范围内，线性较好，曲线方程为y=0.010 5x-0.001 1(R2=0.999 8)。

2.7.2重复性与回收率

表1 重现性测试

由表1可知，RSD为1.88%、2.30%和2.86%，精密度较高。

在取样变性淀粉样品1、样品2和样品3(羟丙基含量按GB/T40998—2021测定为5.2%、3.0%、1.5%)0.05 g上加标1.00 mL 1.00 mg/mL 1,2-丙二醇储备液。

由表2可知，对于落在曲线不同位置的数据回收率良好，符合实验要求。

3 结论与分析

本文改良的分光光度计测定变性淀粉中羟丙基含量得试验方法。在80 ℃～85 ℃水浴脱水反应10min，相比原方法准确沸水浴3 min拉长了操作时间，降低了水浴温度，可以在大量样品的实验中，显著提高可操作性。在脱水反应前后进行常温水浴1 min，相比原方法中立即切换冰/沸水浴，可以有效防止试管爆裂，提高安全性。在线性范围内数据的回收率与精密度均良好，符合实验要求，可用于日常的检测中。

表2 回收率测试

硫酸的吸水性使得开封的硫酸浓度随时间推移而下降。在现有的加热条件下，实验结果对硫酸浓度敏感性大，因此实验脱水用硫酸应确保密封，实验样品不宜过多，以防前后样品硫酸浓度差异而影响实验结果。