影响植物乳杆菌在肠道中的定殖因素及适应性研究进展

陈 妍， 裴碧红， 王健泽， 丁同仁， 王 佳， 郑诗琪，夏永军， 艾连中， 王光强

上海理工大学健康科学与工程学院， 上海食品微生物工程技术研究中心， 上海 200093

益生菌是活的微生物，以适量的剂量给予宿主会对宿主健康产生有益影响[1]。目前人们通常会选择含有益生菌的发酵食品和补充剂来预防一些生理疾病，这些益生菌可以定殖于肠道宿主黏膜或上皮[2,3]、免疫系统[4]并与本身微生物[5]密切相互作用，从而对宿主产生重要的影响。主要存在于奶类，肉类以及蔬菜发酵制品中的植物乳杆菌与人类的生活密切相关，可以寄居在人和动物的口腔以及肠道中并发挥有益作用[6]。它们对宿主具有许多重要的功能，但是菌株发挥作用的先决条件就是首先能在胃肠道中存在并定殖。ZMORA N[7]等人分析了益生菌在小鼠以及人体肠道黏膜的定殖情况和规律，结果发现不同的益生菌对肠道黏膜的定殖情况存在个体差异，对不同的宿主以及定殖位点都具有很大的差异。但目前关于益生菌在体内的定殖机制尚不完全清楚，影响定殖的因素也未得到全面的阐述，因此揭示益生菌的定殖机制，已成为益生菌行业亟待解决的关键问题。

1 植物乳杆菌的生理功能

1.1 免疫调节作用

根据研究表明，植物乳杆菌表面的许多活性因子，如菌体表面的糖类和蛋白等都具有一定的免疫调节作用，定殖到肠道的上皮细胞后会刺激机体的免疫细胞进而影响整个黏膜免疫系统的功能。PERDIGN等[8]研究饲喂L.plantarumCRL936后对小鼠的免疫调节作用，发现这种植物乳杆菌可以诱导派尔集合淋巴结 (Peyer’s patches)以及肠上皮中的免疫细胞，从而增强了宿主的免疫功能。蒙月月等[9]探讨植物乳杆菌KLDS 1.0318对小鼠免疫调节功能的影响，研究发现植物乳杆菌KLDS 1.0318主要是通过促进机体的特异性以及非特异性免疫功能来增强对宿主的免疫作用。这些研究都表明植物乳杆菌对免疫调节会起到一定的作用。

1.2 对致病菌有拮抗作用

最近的研究表明，植物乳杆菌可以产生不同的抗菌物质，如有机酸、过氧化氢、双乙酰、抗菌肽、细菌素等。其产生的有机酸包括乳酸和苯基乳酸，这些酸对致病性和腐败微生物均具有很好的抗菌作用。ANUKAM等[10]从尼日利亚健康女性阴道中分离得到了具有对致病菌产生作用的植物乳杆菌，其主要产生作用的是菌体产生的表面活性剂如H2O2，这种物质会抑制肠道和阴道致病菌的产生。LASH等[11]发现L.plantarumATCC 801的菌体表面会分泌一种细菌素，这种物质可以有效的抑制革兰氏阳性菌和阴性菌的生长，产生一定的抑菌作用。因此合理的使用植物乳杆菌可以调整肠道内菌群的关系，有效的抑制病原菌的生长，对人体健康产生有益作用。

1.3 降低血清胆固醇含量和预防心血管疾病

近年来许多研究都表明植物乳杆菌的使用可以有效的降低血清中胆固醇的含量，所以这类研究也受到了广泛的关注。NGUYEN等[12]用L.plantarumPH04饲喂具有高脂血症的小鼠模型，研究发现14 d后血清胆固醇和甘油三酯显著降低，但是其食物摄入量、不同小鼠体重以及内脏重量指数差异不显著。KLAVER等[13]研究认为，乳酸菌对胆固醇的降低作用主要是由于胆固醇在酸性条件下(pH < 6.0)会与胆盐形成了沉淀，从而降低了培养基中胆固醇的含量。裘迪红等[14]人从泡菜中分离获得一株植物乳杆菌，并利用此菌发酵乳制品，研究发现其制备的发酵乳能有效的降低高脂小鼠肝脏和血清中的总胆固醇(TC)以及甘油三酯(TG)水平，调节促进宿主健康。

1.4 其他生理功能

大量的研究发现植物乳杆菌还具有很多其他的生理功能，如维持肠道内菌群生态平衡、加快营养物质吸收以及抑制肿瘤细胞的形成等。多种益生菌及其制剂已被用于研究诱导和维持溃疡性结肠炎(UC)的缓解，大肠杆菌Nissle1917和VSL#3已被证明对预防和治疗轻中度溃疡性结肠炎有显著益处。伍静等[15]在大麦发酵中添加乳酸菌进行研究，研究发现其发酵提取物(LFBE)可以诱导人结肠癌HT-29细胞的凋亡和裂解从而抑制人结肠癌HT-29细胞的增殖。因此研究植物乳杆菌具有重要的应用价值以及广阔的前景。

如今，消费者对天然健康食品的需求日益增加，生物保护成为人们关注的焦点。植物乳杆菌具有多种功能，能有效满足消费者的需要，也是研究的热点。而黏附并定殖到肠黏膜被认为是植物乳杆菌发挥作用的前提条件，因为定殖会增加它们在肠道中的持久性，从而使益生菌发挥作用。

2 影响菌株在肠道定殖的主要因素

2.1 对碳源的利用能力

人类肠道中含有丰富的碳水化合物，这些碳源为不同的肠道菌群提供了多样的营养位点，这些肠道菌群之间通过对有限碳源的竞争从而促进其生长并形成一个相对稳定的肠道微生态系统，并且碳源对肠道菌群也具有一定的调节作用。人类肠道菌群所编码的关于多糖代谢相关的酶类远远高于人类自身基因组，从而证实了肠道菌具有强大的碳源利用能力，所以菌株可以利用肠道中有限的碳源也成为菌株存活并定殖的主要因素之一。

ZHANG等[16]发现LactobacillusfermentumYLF016对肠道细胞具有较强的黏附能力并可在肠道中长时间定殖，所以分析了菌株的全基因组并研究其益生菌特性，发现其编码了较多的碳代谢、碳水化合物转运蛋白以及适应多样性相关基因从而促使其具有良好的益生菌潜力。CHEN等[17]研究了LactobacillusreuteriWHH1689并揭示其益生菌功能相关基因，研究表明其富含编码碳水化合物转运和酶、碳代谢途径以及黏附能力的相关基因，从而促使其在人体肠道中定殖并在乳制品中广泛应用。目前为止，虽然没有直接证据证明菌株对碳源的利用情况是否会影响其在肠道环境的定殖，但是有关研究结果表明能在肠道中定殖并发挥有益作用的菌株都具有相当大的与碳代谢编码的基因，为此提供了有力的间接证据，并且额外提供膳食多糖会对目标菌群具有一定的调节作用。

2.2 对胃肠道环境的抵抗力

大多数益生菌能够黏附在肠道细胞上并在肠道环境中发挥不同的有益作用，其中发挥作用的有效程度取决于进入肠道的活细胞数量，并且能够在人类肠道中持续存在并存活。益生菌一般具有一定的抵抗胃液和肠液、胆汁和胰腺分泌物的能力，这有助于其在胃肠道中定殖。ZHAN等[18]研究了16个乳酸杆菌对模拟胃肠液的耐受能力发现植物乳杆菌菌株 CCFM 737、CCFM 10、CCFM 634表现出对模拟胃肠汁的高耐受性，而且在动物实验的粪便样品中这些菌株也显示出它们具有相当高的定殖水平，至少可以在体内定殖两周。JACOBSEN等[19]对47株乳酸菌的益生菌潜力进行了研究，研究发现菌株在体内的存活情况与pH的耐受性、黏附性以及体外抗菌特性有关，从而影响菌株定殖的持久性。

2.3 与其他菌群的竞争性

摄入人体的菌株可以通过产生代谢产物从而获得定殖优势，并与其他病原菌进行竞争，促使其定殖。有研究表明B.longum可以通过产生醋酸盐来保护感染了大肠杆菌O157的肠道上皮细胞，而拟杆菌菌株能通过产生丙酸盐而不改变宿主免疫途径直接促使其能在沙门氏菌感染的肠道中获得定殖能力[20]。MAO等[21]人通过研究乳酸菌小鼠肠道的定殖中发现其产生的乳酸会明显的改变小鼠肠道的pH，并对霍乱弧菌在肠道的定殖有显著的抑制效果从而促使乳酸菌的定殖。TOSCANO M等人[22]研究了LactobacilluskefiriLKF01在不同人体肠道中的定殖情况并对本土菌群的影响，结果表明口服益生菌一个月后观察到的乳杆菌数量增加而沙门氏菌、梭状芽孢杆菌、链球菌等细菌属显著减少，从而间接反映了益生菌在肠道中的竞争性定殖。菌株产生的其他代谢物可能与宿主免疫系统密切相关，如Reuri能促进CD4+T细胞分化为免疫调节性T细胞，并诱导IL-12[23]，这些均有可能影响细菌的定殖。

2.4 菌株黏附能力

植物乳杆菌在肠道中发挥生理功能的前提和基础是其能在肠道中可以稳定的黏附定殖。菌株可以定殖的前提条件是其在人体肠道中黏附并获得相应的生态位。菌株从体外黏附亲和到体内分子的相互作用的证据表明，菌株主要通过外层分子结构，如外膜蛋白、菌毛、微毛和鞭毛等黏附在宿主细胞上，从而促进细菌的定殖[24]。菌毛基因SpaC对鼠李糖乳杆菌在人体肠道黏液的结合至关重要[25]。而嗜酸乳杆菌NCFM 中编码s层蛋白的SlpA基因失活会导致其对Caco-2细胞黏附减少，并改变其细胞形态[26]。KOS等[27]对嗜酸乳杆菌M92进行研究，结果表明嗜酸乳杆菌M92的黏附能力与其自动聚合能力之间存在相关关系，这也可能与细菌表面的蛋白有关。MACAS-RODRGUEZ等[28]人在乳酸菌BCS87中检测到表面有两种黏附蛋白，研究发现这两种蛋白对宿主-菌株相互作用至关重要，促进了在猪肠道中的定殖。

益生菌在肠道中发挥生理功能的前提是其能定殖于肠道中。而我们综述发现影响菌株定殖的因素很多，比如菌株的碳源利用能力、菌株抵抗胃肠道环境的能力以及黏附能力，这为益生菌株的体外筛选提供了理论依据。

3 植物乳杆菌在肠道中适应性研究

益生菌经常作为治疗和改善胃肠道疾病的药物，与其他药剂不同的是它是活的微生物，可以在肠道中适应并定殖从而长期对宿主发挥长久效应[29]。益生菌在肠道定殖期间往往会发生自发的适应性突变从而得到更好的定殖效果[30]。例如对碳源利用能力，酸性条件适应以及对肠道免疫环境和离子环境的适应能力等[31]，这为筛选定殖能力强的菌株提供了有效菌库和有效方法。

3.1 对肠道中有限碳源的适应性

在肠道中利用碳水化合物的能力是肠道微生物生长所必须的生理代谢过程。碳水化合物代谢为肠道共生体提供碳源和能量，促进细菌在肠道内的建立和存活。在双歧杆菌中近14%的注释基因编码与碳水化合物代谢有关的酶[32]，其中两歧杆菌是最能代谢人类来源多糖(黏蛋白)的菌种[33]，而参与处理黏蛋白来源的碳水化合物基因元件赋予了双歧杆菌肠道定殖优势，成为人类早期生命中的先驱定殖者。其他双歧杆菌种，包括长双歧杆菌亚种、婴儿和短双歧杆菌也具有这种黏液蛋白降解能力和相关基因[34]。在乳酸菌中，肠道乳酸杆菌富含黏液结合蛋白[35]，从而具有更多样化的碳水化合物代谢能力促进其在体内的定殖。

CHANG等[36]为了探究大肠杆菌在肠道中所需的营养物质，构建大肠杆菌突变菌株来来适应小鼠肠道，研究表明只有糖代谢的相关突变会影响大肠杆菌在肠道中的丰度，而其他代谢途径的相关突变没有影响菌株在肠道中的存活能力，从而推测有关碳水化合物的利用能力是影响大肠杆菌在肠道中生存适应的主要因素。在人体肠道中具有丰富的碳水化合物，为不同菌群的定殖繁殖提供营养物质，从而形成稳定并多样的肠道微生态系统。NATHAN[37]在哺乳动物肠道中对益生菌候选菌株E.coliNissle的适应性进行研究，研究表明在低微生物组多样性的背景下，对EcN的最大选择压力是碳源限制，肠道中的碳水化合物的可利用性驱动了大肠杆菌Nissle在体内的适应性定殖，同时EcN通过代谢竞争其肠道生态位。目前，碳源对肠道菌群的调节作用也已得到了广泛的证实，但其是否起决定作用还需要进一步的实验证明。

3.2 对胆盐和酸的适应性

菌株在人体胃肠道定殖的前提是菌株要能肠道中存活，因此通常会具有一定胆盐和酸的抵抗力，从而通过层层阻扰定殖于肠道中。HUANG等[38]研究了候选益生菌Lp082是如何在人和小鼠这两种哺乳动物宿主模型中通过获得相关基因组的遗传变化，实验结果表明，Lp082积累了调节鼠李糖利用和酸耐受性的单核苷酸突变，提高Lp082在宿主肠道中的存活率从而促进了在体内的定殖。KRUMBECK J A等[39]在L.reuri100-23中研究发现UREC基因的缺失会显著降低了其生态适宜性，其中UREC基因编码一种与耐酸有关的蛋白质。SHEEHAN等[40]在B.breveUCC2003中表达了李斯特甜菜碱摄取系统(Betl)发现显著提高了菌株对胃液的耐受性，并促使其具有更强的定殖能力。同样，O’FLAHERTY S[41]发现胆盐水解酶基因(L.acidophilusNCFM的bshA和L.johnsoniiNCK88的bshB)在大肠杆菌C600中的异源表达与对照大肠杆菌C600相比，在无菌小鼠粪便中的定殖量显著增加。

3.3 对免疫环境的适应

肠道作为消化和吸收营养物质的关键部位，也是宿主与外界环境相连的主要器官，但是其渗透性表层往往会使得病原微生物通过肠道并进入人体，因此面对这些病原菌的侵袭肠道会激发出免疫反应对这些病原菌进行监控和清除，来保护身体不受外界的侵害[42]。肠道免疫系统通过分泌黏液，抗菌物质形成表面的物理屏障，同时肠道表皮下的免疫细胞通过吞唾、杀伤、抗体反应及细胞因子等清除外来抗原及病原体[43]。肠道免疫系统在有效抵抗外来抗原以及致病菌的同时对肠道共生菌群保持免疫沉默。因此肠道菌群对肠道免疫系统的适应能力是菌株在肠道中定殖的重要挑战。

为了避免被肠道免疫反应根除，益生菌菌株通常具有轻微(非促炎)的免疫调节作用。研究表明植物乳杆菌胞外多糖降低菌株的免疫反应[44]。LGG胞外多糖的突变株对多糖的黏附能力增加，但是在肠道中的定殖能力降低，进一步研究发现，变异株对肠道初始免疫因子如LL-37抗菌肽及补体的敏感性增加，说明菌体表面多糖可以保护菌株抵抗肠道免疫反应，增加菌株在肠道中的定殖能力[45]。B.breveUCC2003胞外多糖增强了菌株对环境中酸和胆盐的耐受性，对菌株在肠道中定殖无影响，但是会影响菌株在肠道中的驻留时间[40]，进一步研究发现，多糖的突变增加了菌株在小鼠肠道中的免疫反应，这种免疫排斥可能是影响菌株在肠道中长期存在重要的原因[46]。

定殖较强的菌株往往具有一定的免疫调节能力，有研究表明口服植物乳杆菌可以在人体的十二指肠诱导对免疫反应起调节作用的基因，而不会引起炎症相关基因的诱导，也不会出现明显的免疫细胞渗透[47]。因此菌株的适应性研究应考虑摄入菌株是否会对机体产生免疫反应以及与对本土微生物群的相互作用。

3.4 对肠道离子环境的适应能力

肠道中的离子环境不同于体外培养的环境，肠液的缓冲能力、渗透压、表面张力、pH等均会影响摄入菌株的定殖能力。而且这些因素对生物的代谢及活性都有重要的影响，并且某些金属离子作为微生物酶的辅酶、信号分子等对其生存及活性存在至关重要作用。

有研究表明高渗透压环境会促进如Campylobacterjejuni生物膜的形成，促进菌株在多种环境中生存并适应[48]。SalmonellaentericaTat的变异菌株对表面活性剂及离子整合剂的耐受能力降低，从而对宿主的感染力及定殖能力降低[49]。因此肠道黏膜的离子环境的改变对菌株的存活以及定殖也具有重要的影响。

如何筛选获得一株定殖能力强的菌株是一项繁琐的工作，但是通过体内的适应性进化，尤其的对于已经具有益生功能的菌株，想提高其定殖能力，通过适应性进化，可获得大量的突变菌株，进而从此库中定向筛选出定殖能力强的菌株，从而大大提高筛选效率。

4 展望

近些年来，人们越来越关注到自身的身体健康。人体肠道菌群的研究成为一个研究热点，然而乳杆菌对人体发挥作用的第一步就是其能在肠道内黏附并长时间定殖，研究了解菌株与机体之间的相互作用，可以预防致病菌的感染，评价和促进菌株在肠道内发挥益生效果等。因此，了解菌株在肠道中的定殖机制以及菌株的适应性进化方向对益生菌的理性筛选具有重要的指导意义。