超高浓度乙醇连续发酵体系振荡行为诱发因素研究

谭慧萍， 王惠国， 王林会， 赵增彤， 程杨好， 刘晨光， 王 亮*， 李 倩*

1.大连大学生命科学与技术学院，辽宁大连 116622；

2.大连赛姆生物工程技术有限公司，辽宁大连 116620；

3.大连工业大学生物工程学院，辽宁大连 116034；

4.微生物代谢国家重点实验室上海交通大学生命科学与技术学院，上海 200240

上世纪末，学术界相继提出了高浓度（High gravity，HG）和超高浓度（Very high gravity，VHG）发酵的概念，并成功将其应用到乙醇发酵中，使发酵终点乙醇浓度从6%～8%（v／v）提高到10%～21%（v／v）［1，2］。VHG乙醇发酵技术不仅能够降低下游精馏分离和废水处理成本，而且不需要增加额外的设备投入，是降低燃料乙醇生产成本的有效方案［3，4］：（1）燃料乙醇生产成本中，能耗成本居第二，仅次于原料成本；（2）市场上存在多种廉价高效的酶制剂，如α-淀粉酶、糖化酶和蛋白酶等，这使得超高浓度底物易获得。

周期性的振荡行为在微生物细胞连续培养和发酵过程中时常发生，如Saccharomyces cerevisiae［5，6］、Zymomonas mobilis［7］、Escherichia coli［8］和Clostridium butyricum［9］等培养过程都曾观察到这一现象。对于酿酒酵母S．cerevisiae低糖连续培养过程中的振荡行为已经研究得较为透彻，主要分为糖酵解振荡和代谢振荡行为，其振荡参数包括葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、ATP、NADPH等胞内代谢物浓度，以及溶氧浓度（DO）、耗氧速率、二氧化碳释放率等发酵参数，振荡周期在几分钟到几小时之间。然而，BAI等在酿酒酵母VHG乙醇连续发酵体系中报道了另一种振荡行为（VHG振荡）［3，10-11］，明显不同于糖酵解振荡和代谢振荡，这种振荡行为的振幅更大（可达50%）、周期更长（5 d～7 d），振荡的特征参数包括残糖、乙醇和生物量浓度等。随后，BAI等在研究稀释速率（0.015 h-1～0.08 h-1）对VHG乙醇连续发酵影响时，发现改变稀释速率可以获得振荡和稳态两种不同发酵状态［12］，并提出VHG振荡行为的产生与操作条件和系统的初始状态有关。

虽然后续研究显示，木块固定化细胞［10，13］和发酵偶联气提实时移除部分乙醇［14，15］可以有效弱化VHG振荡行为，然而，除稀释速率外，缺乏对VHG振荡行为直接诱发因素的研究。本研究基于前期研究基础，研究菌种、培养基成分、氧供应等对VHG振荡行为的影响，进一步探究了比生长速率、比死亡速率、稀释速率和细胞乙醇耐受性对酿酒酵母VHG乙醇连续发酵的调控作用。

1 实验材料和方法

1.1 菌种

实验室酿酒酵母S．cerevisiae S288c和工业酿酒酵母S．cerevisiae 4126均由本实验室保藏；自絮凝酵母S．cerevisiae BHL01，由工业酿酒酵母S．cerevisiae 4126经染色体整合絮凝基因FLOI得到［16］，由本实验室保藏。

1.2 培养基

摇瓶种子培养基（g／L）：葡萄糖30，酵母粉5，蛋白胨3，121℃灭菌15 min。

发酵罐种子培养基（g／L）：葡萄糖120，酵母粉5，蛋白胨3，121℃灭菌15 min。

YPD发酵培养基（g／L）：葡萄糖280，酵母粉5，蛋白胨3。为减少在高温灭菌过程中的糖损失，发酵培养基灭菌条件为110℃，15 min，灭菌完成后立即用自来水冷却至室温。

合成培养基：氮磷镁成分（g／L）（NH4）2SO45，KH2PO43，MgSO4·7 H2O 0.5，121℃灭菌15 min。微量盐成分（mg／L）EDTA 15，ZnSO4·7 H2O 4.5，CoCl2·6 H2O 0.3，MnCl2·4H2O 1，CuSO4·7 H2O 0.3，CaCl2·2 H2O 4.5，FeSO4·7 H2O 3，NaMoO4·2 H2O 0.4，H3BO31，KI 0.1，121℃灭菌15 min。维生素成分（mg／L）生物素0.05，泛酸钙1.0，烟酸1.0，肌醇25.0，维生素B11.0，维生素B61.0，对氨基苯甲酸0.2，0.45μm膜滤除菌。厌氧发酵过程培养基中添加15μL麦角固醇和660μg／L Tween-80，为酵母细胞膜合成提供前体，115℃灭菌15 min。各组分配制成高浓度母液，并单独进行灭菌，4℃避光保存，使用前配制成所需终浓度，添加到葡萄糖溶液中。

1.3 种子培养及乙醇连续发酵

摇瓶种子培养：从4℃冰箱中取菌种保存试管，接种到170 mL种子培养基中进行活化，在30℃，150 r／min条件下培养20 h。将活化后种子转接到新鲜的种子培养基中，30℃，150 r／min培养18 h。

发酵罐批次种子培养：摇瓶种子以10%（v／v）的接种量接入装液量为1.7 L的搅拌式发酵罐（KBT-2.5 L，韩国）中进行培养，通过流加2 mol／L NaOH控制pH在（4.50±0.02），通气速率、温度、搅拌速率分别设定为0.05 vvm、30℃、300 r／min。

连续乙醇发酵：连续搅拌反应装置如图1所示，当培养基中的残糖浓度低于1 g／L，分批种子培养结束，开启蠕动泵3以0.027 h-1的稀释速率向发酵罐4中流加发酵培养基，同时打开发酵罐的溢流口，通过溢流口控制有效发酵体积为1.7 L，温度、pH、通气、搅拌速率等操作条件与发酵罐种子培养时相同。

图1 乙醇连续发酵系统示意图

1.4 分析方法

1.4.1 生物量测定

选用细胞干重法进行测定［3］。

1.4.2 葡萄糖、乙醇和甘油的测定

选用Waters高效液相色谱测定，选用色谱柱（Aminex HPX287H，300 mm×7.8 mm）；检测器选用Waters410示差检测器；流动相用5 mmol／L的H2SO4；流速设为0.5 mL／min，柱温设为50℃。

1.4.3 酵母乙醇耐受性实验［17］

将斜面菌种进行摇瓶活化后，用生理盐水（0.9%NaCl，w／v）配制成相同OD600的菌悬液，分别用12%和16%（v／v）的乙醇溶液冲击2 h，涂平板，30℃培养24 h后，计细胞菌落数，与0 h的对照菌落数对比计算存活率。

2 实验结果与讨论

2.1 菌株差异对VHG乙醇连续发酵的影响

2.1.1 酵母菌株的乙醇耐性比较

本实验选取三株酿酒酵母S．cerevisiae 4126、S．cerevisiae S288c和S．cerevisiae BHL01，分别进行了乙醇冲击实验，比较其乙醇耐受性，结果如图2所示。经12%（v／v）乙醇冲击2 h后，酵母细胞S．cerevisiae 4126和S．cerevisiae BHL01的存活率分别为81.5%和88.1%，而S．cerevisiae S288c只有66.1%；经16%（v／v）乙醇冲击2 h后，只有S．cerevisiae BHL01的存活率能够维持在43.3%，而S．cerevisiae 4126和S．cerevisiae S288c的存活率则分别降至27.2%和16.3%。可见，这三株酵母菌株的乙醇耐性由高到低依次为S．cerevisiae BHL01、S．cerevisiae 4126及S．cerevisiae S288c。

图2 酵母菌株的乙醇耐受性比较

2.1.2 不同乙醇耐性菌株的VHG乙醇连续发酵

S．cerevisiae 4126、S．cerevisiae S288c和S．cerevisiae BHL01三株乙醇耐性不同的酵母菌的VHG乙醇连续发酵参数（残糖、乙醇、甘油和生物量浓度等）如图3所示，发现S．cerevisiae 4126及S．cerevisiae BHL01连续发酵体系中发酵参数均呈现周期性振荡行为（图3a、3b），而类似振荡行为未在S．cerevisiae S288c连续发酵体系中观察到，随发酵时间延长S．cerevisiae S288c体系逐渐发展成高底物浓度（136.4 g／L～149.8 g／L）、低产物浓度（46.5 g／L～56.8 g／L）的拟稳态状态（图3c），表明VHG振荡行为的产生与菌种有关。

图3 三株不同乙醇耐受性酵母菌的VHG乙醇连续发酵

如表1所示，S．cerevisiae BHL01、S．cerevisiae 4126和S．cerevisiae S288c VHG连续发酵体系的最大乙醇浓度分别为88.4 g／L、71.3 g／L和56.8 g／L，可见S．cerevisiae BHL01和S．cerevisiae 4126的乙醇生产能力要强于S．cerevisiae S288c，这与其乙醇耐受性数据一致。另外，三株酵母菌的VHG体系中乙醇浓度变化幅度也是S．cerevisiae BHL01最大（31.6 g／L）、S．cerevisiae 4126其次（20.0 g／L）、S．cerevisiae S288c最小（5.2 g／L），同样其乙醇生成速率也具有这样的大小关系。高乙醇生成速率会造成胞内乙醇积累，胞内的高浓度乙醇会严重损伤和破坏细胞器和酶，导致细胞活力下降甚至死亡［18］。以发酵参数的振幅而言，S．cerevisiae BHL01发酵体系的参数波动要明显强于S．cerevisiae 4126体系，而S．cerevisiae 4126体系要强于S．cerevisiae S288c体系，这种强弱关系与三株酵母菌的乙醇耐受性强弱一致，表明VHG振荡的强弱可能与酵母细胞的乙醇耐受性有关。

表1 三株酵母菌的VHG乙醇连续发酵参数

S．cerevisiae BHL01、S．cerevisiae 4126和S．cerevisiae S288c VHG发酵体系的参数变化显示，S．cerevisiae BHL01和S．cerevisiae 4126体系的乙醇浓度都超过了其最大乙醇耐受浓度，发酵体系中的高浓度乙醇对细胞的生长和代谢产生了抑制作用；而S．cerevisiae S288c的乙醇发酵生产能力弱，在VHG连续发酵过程中，当乙醇浓度达到46.5 g／L～56.8 g／L时（低于其最大乙醇耐受浓度），同时细胞的乙醇生产能力达到极限，发酵液中乙醇浓度不会继续增加，不会对酵母细胞的生长代谢和乙醇合成代谢产生明显抑制作用，乙醇生成速率维持在恒定水平。此时，细胞乙醇生成与细胞乙醇耐性之间达到了一定平衡，最终发酵体系达到了含有约150 g／L的残糖浓度的拟稳态。S．cerevisiae BHL01、S．cerevisiae 4126和S．cerevisiae S288c VHG发酵体系的参数变化表明，酵母细胞的乙醇耐受性对VHG振荡行为具有重要影响，在同一发酵体系中菌株乙醇耐受能力越强，其诱发的振荡行为越剧烈。

2.2 乙醇胁迫对S．cerevisiae 4126 VHG乙醇连续发酵的影响

基于上述研究结果，本实验以低糖稳态体系［15］为对照体系，向其中流加含50 g／L或70 g／L乙醇的低糖发酵培养基，考察外源乙醇胁迫对VHG连续发酵过程的影响（见图4）。这里的对照体系指以S．cerevisiae 4126为实验菌株、流加含有低浓度葡萄糖（120 g／L）的培养基进行乙醇连续发酵可达到稳态系统。

图4 外源乙醇添加对酵母细胞低糖乙醇连续发酵体系的影响

图4显示，外源流加50 g／L乙醇能够诱发低糖稳态体系产生周期性振荡行为，残糖、乙醇和生物量（DCW）浓度分别在（39.0～99.1）g／L、（49.5～84.4）g／L和（0.4～3.8）g／L范围振荡，平均浓度分别为67.7 g／L、66.7 g／L和1.9 g／L，振荡周期约为105 h。此外，添加30 g／L或40 g／L乙醇时，均能够诱导周期性振荡行为，且高浓度外源乙醇能够诱导更长周期、更大振幅的振荡行为［15］。然而，当添加更高浓度乙醇（70 g／L）时，发酵参数变化却并不显著，残糖、乙醇和生物量浓度分别在106.0 g／L～114.1 g／L、62.8 g／L～73.8 g／L和0.03 g／L～0.6 g／L范围波动。生物量平均浓度不到0.5 g／L，表明此时细胞生长几乎被完全抑制，而且流加培养基中底物葡萄糖仅消耗10 g／L左右，挥发损失使得发酵液中乙醇浓度（62.8 g／L）甚至低于流加培养基中初始浓度（70 g／L），表明外源70 g／L乙醇施加的抑制程度超过了连续发酵体系中酵母细胞的乙醇耐受性。

研究结果表明，在酵母细胞可耐受范围内，通过向低糖稳态系统中外源添加乙醇，对细胞施加抑制，可诱发稳态系统的发酵参数出现周期性振荡行为，且施加的乙醇抑制越强，诱发的振荡行为振幅越大、周期越长，而当外源添加乙醇解除时，发酵体系会逐渐恢复到稳态状态。

2.3 培养基组成和氧供应对酿酒酵母振荡行为的影响

前期研究表明，乙醇连续发酵体系振荡行为是一种复杂生物行为，是胞外以及胞内因素共同作用的结果［15］，基于S．cerevisiae 4126 VHG连续振荡体系，本实验选取了对细胞生长状态有影响的培养基组成和通气供应来考察振荡行为受到的影响。

如图5所示VHG乙醇连续发酵，使用营养丰富的YPD培养基时，发酵参数呈现大幅度、周期性振荡行为。然而，将流加培养基切换成合成培养基后，虽然200 h内也观察到了较为明显的参数振荡行为，但运行约300 h后发酵参数的振荡幅度逐渐变小，最后趋于稳定，维持在高残糖（～160 g／L）、低乙醇（～50 g／L）浓度水平，这种振荡行为类似阻尼振荡。

图5 培养基组成对酵母细胞VHG振荡行为的影响

YPD培养基能够给酵母细胞提供足够养分，维持细胞合成以及分解代谢，在无乙醇抑制条件下，能够使细胞获得高比生长速率和高乙醇比生成速率。然而，合成培养基中营养匮乏，无法提供满足酵母细胞生物量积累及乙醇发酵的充足营养，限制了细胞生长和乙醇生成速率，随着连续发酵的进行，发酵液中的乙醇浓度和细胞浓度不断被稀释，最后维持在一个低乙醇浓度的环境下，避免了发酵体系中出现高浓度乙醇以及乙醇浓度动态变化产生的抑制作用。

图6所示，停止通气对发酵体系参数振荡行为影响显著，通气停止后酵母细胞生物量积累以及乙醇生成受到了明显抑制，浓度逐渐减少，同时发酵液中残糖浓度不断升高，振荡行为逐渐消失。供氧对细胞生长非常重要，氧分子参与细胞中氧化磷酸化过程产生大量ATP，为细胞代谢活动提供能量，而在厌氧条件下1分子葡萄糖通过糖酵解途径仅能产生2分子的ATP，能量供应相对不足。虽然VHG乙醇连续发酵过程中通气速率较小，仅0.05 vvm，但溶解氧被细胞利用后使糖酵解产物丙酮酸进入TCA循环得到进一步氧化，为酵母细胞代谢提供足够ATP。因此，供氧或能量供应有助于酵母细胞VHG连续振荡行为的维持，表明这是一个耗能过程。

图6 供氧对酵母细胞振荡行为的影响

2.4 VHG振荡行为分析

VHG乙醇连续发酵过程中，酵母细胞遭受高浓度底物的渗透压胁迫以及高浓度产物乙醇的抑制作用，周期性振荡行为的产生是环境和细胞因素综合作用的结果［15，19，20］。前期研究表明，高浓度底物的渗透压胁迫以及细胞周期变化与VHG振荡行为无直接关联［15，19］，通过木块固定化提高酵母细胞乙醇耐受能力［10，13］和发酵偶联气提操作实时移除发酵液中部分乙醇［14，15］都能够有效弱化VHG振荡行为，且通过改变VHG乙醇连续发酵的稀释速率可以切换稳态和振荡状态［12］。本研究结果表明，细胞乙醇耐受性差异（与菌种、外源乙醇胁迫等有关）和细胞生长和能量状态（与培养基组成、供氧等有关）对VHG振荡行为有显著影响。

每株酵母菌都存在一个临界乙醇耐受浓度Ecrit，当发酵体系中乙醇浓度E超过Ecrit时，会对细胞生长和代谢产生抑制作用。在底物葡萄糖过量（280 g／L）和营养充足（YPD培养基）的VHG乙醇连续发酵体系中（无限制性基质存在），细胞浓度变化率和乙醇浓度变化率满足：及稀释速率。

当发酵体系中乙醇浓度E低于Ecrit时，产物乙醇对细胞生长和代谢的影响可忽略（无限制性产物存在），此时细胞比生长速率达到最大μmax，远大于稀释速率D（此时细胞比死亡速率α可忽略不计），发酵体系中细胞不断积累。厌氧或微氧条件下，酿酒酵母的乙醇积累与细胞生长相关，发酵体系中乙醇浓度随细胞生长而不断积累。当发酵液中乙醇浓度E超过临界乙醇耐受浓度Ecrit时，高浓度乙醇会抑制细胞生长使其比生长速率μ逐渐减小，此时比死亡速率α不断增加。在细胞比生长速率μ逐渐减小的过程中，细胞生长速率d X／d t和乙醇生成速率d E／d t随之发生着变化，从式（1）和（2）可知d X／d t和d E／d t的变化趋势并不一致，这与VHG振荡周期中观察到生物量浓度和乙醇浓度曲线的相位差吻合［3，15，19］，文献显示生物量浓度较乙醇浓度先出现下降，在S．cerevisiae 4126 VHG连续振荡体系中这种相位差约24 h，这种差异正是由于细胞生长和乙醇生成对乙醇胁迫的响应不同造成的，这可能是诱导周期性VHG振荡行为的关键。基于此，VHG振荡行为的调控与μ，D和α相关，而α与细胞乙醇耐受性（Ethanol tolerance，Et）密切相关，本研究提出VHG振荡调控与μ，D和Et存在一定函数关系。除稀释速率D外［12，21］，本研究结果证实比生长速率μ（与培养基组成、供氧状态等相关）以及乙醇耐受性Et（菌种差异、外源乙醇胁迫等相关）是VHG振荡行为产生的另外两个关键因素。

3 结 论

其中，X、S0、S、E、μ、qeth、α及D分别表示细胞浓度、流加培养基中初始糖浓度、残糖浓度、乙醇浓度、细胞比生长速率、乙醇比生成速率、细胞比死亡速率

（1）VHG振荡行为的产生与酵母细胞的乙醇耐受性有关，且乙醇耐受性越强的酵母菌的振荡行为越显著；在酵母细胞可耐受范围内，向低糖稳态系统中施加外源乙醇胁迫，可诱发周期性振荡行为，且施加的乙醇抑制作用越强，诱发的振荡行为越剧烈，而当外源乙醇胁迫解除时，发酵体系可恢复到稳态状态。

（2）VHG振荡行为的产生与培养基组成以及氧供应相关，营养和能量供应是维持周期性VHG振荡的重要因素。

（3）VHG振荡行为的产生与比生长速率μ、比死亡速率α、稀释速率D以及乙醇耐受性Et相关，且细胞生长和乙醇生成对乙醇胁迫的响应不同可能是诱发VHG振荡行为的关键。