聚甘油酯对超声制备酪蛋白酸钠-米糠油乳液特性的影响

杨 波， 姚俊胜， 杨 光， 王剑宇

上海理工大学健康科学与工程学院，上海 200093

人造黄油赋予了烘焙食品特有的质地、风味和感官，但是人造黄油中含有大量的饱和脂肪酸甚至含有反式脂肪酸。由于过多的饱和脂肪酸和反式脂肪酸的摄入会出现肥胖及其他疾病，越来越多的消费者会倾向于低脂的烘焙产品。因此脂肪替代物的研究对于改变食品中脂肪含量和研发低脂食品具有重要意义［1］。乳液凝胶可以作为脂肪替代物来降低饱和脂肪酸含量，并提高食品中不饱和脂肪酸、人体必需氨基酸等含量［2］。一般来说，乳液凝胶的制备是通过一些方式来诱导乳状液形成凝胶，所以制备好乳状液是制备乳液凝胶的前提［3］。

聚甘油酯（PGFE）作为新型非离子乳化剂与其他乳化剂有较好的协同作用，具有良好的乳化分散性能，安全性高［4］，在中性、酸性和碱性环境中都相当稳定，而且耐高温性能好，所以被广泛应用到烘焙食品中。酪蛋白酸钠具有很强的乳化增稠作用，可以增进脂肪和水的保持力，蛋白质的特殊表面特性使得它们能够吸附在油水界面上，形成一层厚厚的保护层，降低界面张力，它们作为有效的乳化剂，确保油滴在连续的水相中保持稳定的状态［4］。

目前关于聚甘油酯制备乳状液的文献很少，适宜的乳化剂组成对于乳状液的特性及稳定性也有重要影响。鉴于米糠油和酪蛋白酸钠的高营养价值且米糠油和聚甘油酯具有较高的烘焙价值，本研究以米糠油为油相、以具有亲油性的三聚甘油酯和酪蛋白酸钠为乳化剂，利用超声波制备乳状液，通过测定界面蛋白吸附量、油滴粒径及分布、黏度、乳析率、低场核磁和显微镜观察来确定合适的乳化剂比例来制备乳化特性较好的乳状液，并为之后制备乳液凝胶应用到烘焙食品中提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

食品级酪蛋白酸钠（山东百思特食品健康有限公司），米糠油（浙江得乐康食品股份有限公司），聚甘油酯（山东滨州金盛新材料科技有限责任公司），其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

JY98-IIIDN超声波破碎仪，上海净信实业发展有限公司；DHR-1旋转流变仪，沃特世科技（上海）有限公司；MGL-16M台式高速冷冻离心机，美瑞克仪器（上海）有限公司；E200生物显微镜，尼康仪器（上海）有限公司；Brookhaven动态光散射仪；UPHIV-20TNP超纯水机，四川优普超纯科技有限公司；LC-MSH-PRO磁力搅拌器，邦西仪器科技（上海）有限公司；AL204电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；NMI-20型低场核磁共振分析仪，苏州纽迈科技股份有限公司；FV1200激光共聚焦显微镜，奥林巴斯（中国）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 复合乳状液的制备

在50 mL的烧杯中加入12 g米糠油，另取一个50 mL的烧杯加入8 g蒸馏水。酪蛋白酸钠的质量为油水总质量的0.6%，聚甘油酯的质量分别为油水总质量的0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%。将酪蛋白酸钠加入到蒸馏水中并封上保鲜膜加热搅拌1 h，另一个装有米糠油的烧杯中加入聚甘油酯也同时以相同的温度加热1 h，搅拌结束后将两相混合，利用超声波破碎仪进行超声处理，超声功率为240 W，超声总时间为1 min 30 s（开4 s，关6 s），用1 mol／L的HCl和NaOH将制备好的乳液pH调至7，每个处理组做3个重复。

1.3.2 界面蛋白吸附量的测定

根据KEERATI-U-RAI［5］的方法稍作修改，制作的新鲜乳液在10 000 r／min离心30 min，并用注射器将下层清液吸出，测定清液中的蛋白质浓度。按照下面公式计算界面蛋白吸附量。

式中：C0表示乳液中初始蛋白浓度，g／mL，Cf表示离心后下层清液中的蛋白质浓度，g／mL。

1.3.3 平均粒径及分布的测定

参照杨贵妃［6］的方法用超纯水将待米糠油乳液稀释1 000倍，使用激光粒径仪测定米糠油乳液的粒径，平衡时间为120 s，每组样品测定3次，取平均值。

1.3.4 黏度的测定

采用流变仪测定乳液黏度，取适量米糠油乳液置于40 mm平板上，使其均匀分布。测试温度25℃，剪切速率1 s-1～300 s-1，总剪切时间180 s。

1.3.5 乳析率的测定

取10 mL乳状液样品于带刻度的离心管中，室温下在3 000 g离心20 min，测定油析体积，按照下面公式计算出乳析率：

1.3.6 乳状液的光学显微镜观察

将制备好的新鲜乳液用搅拌棒拌匀，吸取1 mL乳液加入到10 mL的SDS溶液中，混匀后吸取10 μL滴到载玻片上，并盖好盖玻片。将制备好的样片用光学显微镜观察，选择10倍目镜，40倍物镜观察，选择视野清晰，最具代表性的区域进行拍摄。

1.3.7 乳状液的共聚焦显微镜观察

参照KOO C K W［7］的方法，每个样品（1 mL）均用荧光染料预染色（每种染料0.2 mL）。油用尼罗红染色（在1 mL乙醇中1 mg尼罗红），而蛋白用FITC（在1 mL二甲基亚砜中1 mg FITC）染色。将染色剂与样品混合至少3秒钟后，将一滴（0.1 mL）染色样品吸移到显微镜载玻片上，并盖上玻璃盖玻片。尼罗红的激发和发射波长分别为543 nm和605 nm，FITC的激发和发射波长分别为488 nm和515 nm。

1.3.8 LF-NMR分析

参照刘聪慧［8］的方法，采用低场核磁共振分析仪NMI-20（磁场强度0.53 T，质子共振频率22 MHz）分析乳液的T2弛豫行为，取待测样品2.5 mL于核磁管中并在水浴锅中32℃预热10 min。选择CPMG序列进行横向弛豫时间（T2）检测，具体参数为：NS＝8，TW＝2 000 ms，SW＝100 kHz。

2 结果与讨论

2.1 乳状液界面蛋白吸附量的分析

界面蛋白吸附量表示界面吸附蛋白的覆盖率，是研究界面性质的一项重要指标［9］。

由图1可知，随着聚甘油酯添加量的增大，界面蛋白吸附量呈先增大后减小的趋势。这是因为聚甘油酯浓度较低时，较多的酪蛋白吸附在界面上，此时的界面膜是酪蛋白主导。随着聚甘油酯添加量的增多，聚甘油酯和酪蛋白存在竞争吸附作用，界面膜逐渐由酪蛋白主导变成聚甘油酯主导，导致部分酪蛋白被取代下来，所以界面蛋白吸附量降低。DE PILLI T等［10］发现许多小分子乳化剂在与蛋白质共同作用时，能够将作用在乳状液表面的蛋白质解吸下来，最终导致乳状液最终由乳化剂稳定。LI J F等［11］利用荧光光谱研究大豆蛋白和卵磷脂的结合机制时指出磷脂取代界面上部分蛋白质，从而形成蛋白和磷脂的混合界面。

图1 聚甘油酯添加量对界面蛋白吸附量的影响

2.2 乳状液平均粒径及分布的分析

乳状液的平均粒径和粒径分布是探究乳液乳化特性的一项重要指标，一般来说，乳状液中的油滴平均粒径越小，分散越均匀，表示乳化特性越好［12］。

图2a表示的是不同聚甘油酯添加量的乳状液的平均粒径，随着聚甘油酯添加量的增加，乳状液的平均粒径呈现减小趋势。添加聚甘油酯的样品的平均粒径明显小于对照组，添加0.2%（W／W）的聚甘油酯就可以将对照组的平均粒径减小2.5μm左右。这可能是因为聚甘油酯和蛋白质同时作用在油滴表面，二者共同作用导致界面张力减小，因此界面自由能降低，平均粒径减小。当聚甘油酯添加量增加时，作用在油水表面的聚甘油酯增多，乳化效果增强，所以乳状液的平均粒径减小［13］。

图2 聚甘油酯添加量对乳液平均粒径（左）及分布（右）的影响

乳状液的粒径分布图如图2b所示，样品的粒径分布均呈现出单峰，但是峰值不同。单峰分布表明乳状液稳定性较好［14］，表示乳状液中颗粒大小相近且分布均匀。随着聚甘油酯添加量的增加，峰逐渐变窄并向左移动，说明乳状液中的油滴的粒径在逐渐减小，并且油滴大小相近且均匀。因此，适量的聚甘油酯的加入会使酪蛋白与其较好的结合，能够更好稳定水、油界面的平衡，有助于提高蛋白的乳化能力和稳定性。

2.3 乳状液黏度的分析

乳状液的黏度与液滴在体系中运动和迁移的速率有关，黏度大的乳液中连续相和分散相的流动性差，这样有利于保持乳液的稳定。

图3 是乳状液黏度在剪切率1 s-1至300 s-1的变化，随着聚甘油酯添加量的增多，乳状液的黏度逐渐增大，但是所有样品的黏度均随着剪切率的增加而降低。这种乳状液呈现出剪切变稀的行为，说明了该乳状液是非牛顿假塑性流体［15］。一般来说，乳液的黏度与油滴粒径有关，油滴粒径越小，乳状液的黏度会越大。

图3 聚甘油酯添加量对乳状液黏度的影响

2.4 乳状液的乳析率分析

由图4可知，随着聚甘油酯添加量的增加，乳析率呈先下降趋势，当聚甘油酯添加量达到0.6%（W／W）时，乳析率趋于平稳。王才华等发现乳状液中油滴的粒径是影响乳析率的主要因素，然后表观粘度次之［16］。通过Stokes定律可知，乳状液中分散的粒子与分散介质密度差越小、粒子的直径越小，导致黏度变大，因此沉降速度变慢，乳析率减小，乳液的稳定性增加。

图4 聚甘油酯添加量对乳状液乳析率的影响

2.5 光学显微镜观察

乳液微观结构的观察可以直观的表征乳液稳定性［17］。

如图5所示，随着聚甘油酯添加量的增加，乳滴的尺寸逐渐变小，并且乳滴的分布和大小变得均匀。未添加聚甘油酯的乳状液体系中存在较大的脂肪球，当添加了聚甘油酯，乳状液体系中的大脂肪球的数目明显减少，小脂肪球的数目增加。这是因为当聚甘油酯和酪蛋白共同作为乳化剂时，两者在油水界面共存，产生了疏水相互作用和静电相互作用，使乳状液中的液滴分布更加均匀［18］，乳状液的稳定性增加。

图5 不同聚甘油酯添加量的乳液微观结构观察（比例尺：20μm）

2.6 乳状液共聚焦显微镜观察

如图6所示，a是未添加聚甘油酯的乳状液，b是添加了0.6%（W／W）的聚甘油酯的乳状液，聚甘油酯和米糠油被染成了红色，蛋白质被染成了绿色。大量蛋白质吸附在油水界面，但由于光学显微镜的分辨率有限，这一点无法被看到，还有一部分蛋白质分散在水相中。添加0.6%（W／W）的聚甘油酯的样品在共聚焦显微镜下的乳状液的液滴明显小于对照样品。

图6 乳状液的共聚焦显微图

2.7 乳状液LF-NMR弛豫行为分析

图7 是不同聚甘油酯添加量的米糠油乳液的多组分弛豫图谱，图中每一种峰都代表一种状态的氢质子。对照样品中一共发现三个峰，分别是T22、T23、T24，添加了聚甘油酯的样品中可以观察到四个峰，分别是T21、T22、T23和T24。新的T21峰可能与聚甘油酯中的氢质子有关。T23占比最大，该峰与米糠油中的氢质子有关，而T24则代表水中的氢质子。

图7 聚甘油酯添加量对乳状液的多组分弛豫图谱的影响

弛豫时间可以为油和蛋白质的分子动力学提供重要信息，与油滴的流动性和乳状液的结构有关。因此，低场核磁共振T2值提供了油滴流动性的信息，较短的值表明更受限制的运动［19］。对照的T23峰相对较短，可能是单一的酪蛋白乳化效果没有复配的好，所以油滴较大，导致油滴流动性差。随着聚甘油酯的添加，峰值逐渐变小，这可能是因为乳状液黏度变大，流动水减少。聚甘油酯主要通过降低油水界面张力形成乳液，聚甘油酯为氢质子提供了更大的旋转和运动空间，因此其T2弛豫时间较长。

3 结论

在聚甘油酯添加量为0.2%～0.4%（W／W）条件下制备的乳状液具有较多的界面蛋白含量，并且降低了界面张力，提高了乳化稳定性。然而，当聚甘油酯添加量增至0.6%（W／W）时，界面蛋白吸附量降低，不利于蛋白质的利用。

聚甘油酯的添加使油滴的粒径分布更加均匀，添加0.2%（W／W）的聚甘油酯就可以使乳状液油滴的平均粒径降低2.5μm左右。随着聚甘油酯添加量的增加，乳状液的黏度逐渐变大，乳析率降低，当添加量达到0.6%（W／W）时乳析率比未添加降低了大约15%，提升了乳液的稳定性。通过低场核磁的T2弛豫时间的分析得出聚甘油酯的添加增加了油滴的流动性。

聚甘油酯的复合及添加比例对乳状液会产生一定的影响，适量添加聚甘油酯会明显改善酪蛋白酸钠-米糠油乳液的乳化特性，为之后研究乳液凝胶来代替人造黄油提供理论基础。