工业分枝杆菌甾醇代谢基因组学的研究进展

黄莎莎， 苏正定

工业发酵教育部重点实验室和湖北省工业微生物重点实验室湖北工业大学生物工程与食品学院，武汉 430068

甾体（steroids）是一类结构非常特殊的天然产物，其分子母体结构中都含有环戊烷并多氢菲（cyclopentano-perhydrophenanthrene）碳骨架，此骨架又称甾核（steroid nucleus）。甾体化合物又称为类固醇，属于脂类的一种，自然界中有上千种甾类物质，存在于动、植物及某些微生物细胞中。甾体类药物在临床上具有广泛的应用，为仅次于抗生素的第二大类药物。目前工业上主要利用分枝杆菌转化甾醇制备甾体药物起始和中间体原料。目前，人们已对分枝杆菌甾体降解途径中的许多关键酶进行了研究，但对降解途径尚未完全了解。近年来，工业微生物分枝杆菌甾体降解途径基因组分析的重要性引起广泛的注意。为了更深入地了解甾体降解途径，本文介绍了分枝杆菌基因组学、代谢组学的研究进展。

1 甾类化合物简介

甾类化合物是一类特殊的多元环萜化合物，结构上由（A、B、C）三个完整封闭的六元环和一个五元环（D）的环戊烷多氢菲及一些官能取代基组成。甾类化合物包括甾醇、胆汁酸、维生素D、神经甾体以及类固醇激素等，具有重要的生理医药功能［1-2］，如肾上腺皮质激素具有抗炎症等功效。甾类化合物市场需求大，利用微生物法制备甾类化合物的工艺具有环境污染小、专一性较强、反应步骤少、产品回收率高等优点［3，35］。众多微生物菌属中分枝杆菌能够降解甾醇转化关键甾类药物中间体4-雄烯二酮（4-Androstene-3，17-dione，4-AD）、1，4-雄烯二酮（Androsta-1，4-diene-3，17-dione，ADD）、雄甾醇-4-烯-3，17-二酮（9-Hydroxy-4-androstene-3，17-dione，9-OH-AD）。

2 分枝杆菌概况及分解植物甾醇体

分枝杆菌（Mycobacterium sp.）属于放线菌目，是一类细长略带弯曲的杆菌，有分枝杆菌生长趋势，可分为三组：结核杆菌、非结核杆菌与麻风杆菌；结核杆菌和麻风杆菌以危害严重的传染性病原菌闻名，多年来是医学和分子生物学等领域的研究热点。截至2021年6月为止，Genome Online database数据库中共记录了244株分枝杆菌的全基因组测序信息，其中完成测序的为216株，正在测序的有25株，计划测序的有1株，针对性测序的有1例（https：／／www.genomesonline.com）。

非致病型分枝杆菌是常用的工业菌株，具有众多分枝杆菌的重要生理特征，例如该菌细胞壁含有大量的脂质影响甾醇转化活性，主要成分为分支菌酸等［4-5］，其中以胆固醇营养物质等甾醇为唯一碳源并开环降解为自身提供能量。2008年PANDEY等研究中［6］证实结核杆菌降解胆固醇并从中获取能源和能源化合物，结核分枝杆菌维持较慢的感染能力与它获得胆固醇的能力密切相关，也是造成肺结核长时间不愈的重要原因［7］。但是，分枝杆菌降解胆固醇的能力也有其利用价值的一面，即分枝杆菌可转化胆固醇等天然植物甾醇生成系列代谢中间体和药物前体，因而具有重要应用价值。1944年TURFITT等［8］等发现分枝杆菌可完全降解代谢胆固醇侧链和骨架；1972年MARSHECK等［9］利用不需要添加抑制剂的诱变选育方法得到了分枝杆菌NRRL B-3805，能有效转化4AD为睾酮，转化ADD成为AD，从而奠定了分枝杆菌降解甾醇工业化应用的基础。

多种可降解甾类的微生物菌属中，其中以红球菌属与分枝杆菌属代谢能力受到最为广泛的关注，利用诱变选育可作为积累甾药中间体AD等的重要微生物工厂［1，10-14］。红球菌曾经很长一段时间被认为是紫红分枝杆菌，直到1978年才正式承认红球菌这个属名，是介于分枝杆菌与诺卡氏菌Nocardia之间的一类微生物，具有好氧、革兰氏阳性、多形态菌、菌落粗糙与分枝杆菌类似的特点［15］。红球菌属与分枝杆菌属微生物都适用于甾类药物中间体的生产；它们细胞壁产生的表面活性剂有亲水和疏水两种基团，能在水相和油相移动，提高细胞的耐受力，适用于油水两相体系发酵及促进分枝杆菌对甾体化合物底物的摄取［16-18］，拥有完善的甾类降解基因簇、种类丰富的特异性加氧酶、氧化还原酶以及β-氧化酶、确保了微生物对底物的快速代谢［19-22，32］；多数红球菌属与分枝杆菌具有快速生长特点，易培养繁殖，是理想的甾类生物转化媒介。

3 分枝杆菌基因学

自1998年第一个分枝杆菌的M．tuberulosis H37Rv全基因组［23］发布以来，越来越多的研究机构对不同分枝杆菌进行了全基因组测序，分析其基因组特征，不断解析和完善分枝杆菌甾醇降解代谢途径的各个关键酶基因功能，初步绘制甾醇代谢图谱，阐明代谢机制及明确降解机制［33-34］。截至目前为止，多数典型分枝杆菌已经完成全基因组测序（表1）［24］，部分进行了甾醇关键酶的活性测定。通过对不同分枝杆菌进行基因组分析，研究发现分枝杆菌甾体代谢相关基因聚集成簇。GRIFFIN［25］等在对M．tuberulosis H37Rv高通量测序发现摄取甾醇过程中起作用的基因很多，约60%的重要基因位于簇外的基因组其他位置，因此给系统性研究分枝杆菌代谢途径带来极大的挑战。除此之外，一些快速生长型分枝杆菌中广泛存在的同工酶序列与模糊功能基因，也给甾醇降解机制的解析与甾药工程菌的开发构建增加了难度［19，26］。

表1 完成测序的典型甾类代谢微生物

2010年魏巍［27］等以M．neoaurum NWIB-01为菌种，以质粒为载体对该菌株进行Fosmid单克隆基因组测序，通过基因标签的PCR筛选及测序的方法，得到部分的基因簇序列片段约81 kb，发现很多甾醇代谢关键酶。关键酶基因ksdd、ksha、kshb的序列分别为1056 bp、1701 bp、1188 bp。由于分枝杆菌基因组复杂的特殊结构以及有限的测序技术条件，这些先导性基因组学研究难以拼接完整的基因簇，可能错失一些重要的起调控作用基因的信息。

2014年，姚抗［28］对M．neoaurum ATCC 25795全基因组进行了测序和分析，结合基因组测序的重要信息，对代谢通路分子的认识，分别得出三种关键代谢酶，两个编码CHO的基因choM1（编码1746 bp，完整编码581个氨基酸）与choM2（编码1617 bp，编码538个氨基酸）以及一个编码3β-HSD（编码1065 bp，编码354个氨基酸）基因；编码KstD的基因MN-ksD1（编码1701 bp，编码566个氨基酸）、基因MN-ksD2（编码1677 bp，编码558个氨基酸）及基因MN-ksD3（编码1548 bp，编码515个氨基酸），编码KSH的基因还原酶MN-KshB（编码1 069 bp基，编码351个氨基酸）及加氧酶MN-KshA（编码1 188 bp，编码395个氨基酸）。

2017年，徐玲霞［29］等通过Illumina高通量测序技术对M．neoaurum MN4和M．neoaurum MN2进行全基因组测序，采用NGSQCTool kit软件对原始数据进行过滤，再通过Velvet软件对过滤后的数据进行组装，基因组序列如下特点：

M．neoaurum MN4基因组大小为539.053 bp，其基因组共包含5 049个基因，46个tRNA，3个（5 s-16 s-23 s）rRNA；4920编码序列，其中992个CDS编码保守的假定蛋白，3 684个CDS编码具有明确功能的产物；编码序列占整个基因组的90.6%，平均长度为992，GC含量为66.9%，假基因个数为325个。

M．neoaurum MN2基因组的大小为538.301bp，其基因组包含5 049个基因，46个tRNA，3个（5 s-16 s-23 s）rRNA，4 890个编码序列；其中1 435个CDS编码保守的假定蛋白，3455个CDS编码具有明确功能的产物；编码序列占整个基因组的89.8%，平均长度为989，GC含量为66.8%，假基因个数为105个。

通过对两株菌进行基因组进行分析分别得到16条和17条次级代谢产物基因簇，在MN2菌株中发现与甾醇提取相关基因choM1、choM2、3βhsd，MN4中发现关键基因choM1、choM2、3β-hsd以及Kstd-1、Kstd-2、KstA-1、KstB。

2018年，本实验室对分枝杆菌M．neoaurum HGMS2进行全基因组测序［30］，发现其基因组中含有1条染色体，基因组总长度为5 421 383 bp，5 133个基因，占基因组的92.10%。含有5 078个具有编码功能的编码序列，5 001个编码基因，77个假定基因，55个RNA，6个rRNA（2个5S，2个16S，2个23S），46个tRNAs，3个ncRNA。菌株HGMS2基因组圈图如图1所示。

图1 菌株HGMS2基因组圈图

以NRRL B-3805为参考基因，发现菌株M．neoaurum HGMS2多出512个碱基对，无插入突变，32个缺失突变和6个位于编码序列区域的Indel。基于该菌株全基因组序列得到编码三种关键酶的六个基因，分别为：编码3-甾酮-1，2脱氢酶的基因KsdD211为1 692 bp、9α-羟化酶的基因KshA226约为1 185 bp、基因KshA395约为1 149 bp、基因KshB122约为1 056 bp、编码末端碳单氧化酶的基因Mono164约为1 254 bp和基因Mono1973约为1 275 bp。通过基因组信息，预测了三种胆固醇氧化酶（ChoM组1：ChoM1、ChoM2和hsd），两种单加氧酶（Mon组2：Mon164和Mon197），一组侧链降解酶，一组3-酮甾体-1，2-脱氢酶（KstD；组4：KstD211）和3个3-酮甾体-9a-羟化酶（Ksh；组5：KshA226、KshA395和KshB122）。一个编码Mon164、KstD211、KshA226、KshB122和β脂肪酸的基因簇，共同参与M．neoaurum HGMS2中的植物甾醇降解途径。

ASMAR［31］等2014年对分枝杆菌M．DSM 44074菌株进行了基因组测序，其基因编码量为5 112 765 bp，（编码率为92.35%，共鉴定出5 274个基因，其中239个（4.53%）编码假定蛋白，822个（15.59%）编码假定蛋白。此外，5 220个基因在COG数据库中至少匹配一个序列。

4 分枝杆菌的甾醇代谢组学

研究发现分枝杆菌可降解甾醇类物质并将其作为碳源，先降解甾醇的侧链，其次多步催化反应降解为二氧化碳和水。如新金分枝杆菌转化植物甾醇产AD、ADD、9-OH-AD、1，4-HBC、4-HBC等甾体药物中间体。甾醇转化过程中由于代谢分支多，步骤长。基于基因组学获得分枝杆菌的关键基因簇序列，针对代谢途径中的关键基因进行敲除改造微生物分枝杆菌，转化植物甾醇产AD、ADD、9-OH-AD、1，4-HBC和4-HBC等甾体药物中间体代谢产物，采用LC-MS、TLC、HPLC等代谢组学技术定性定量的方法，分析这些菌株甾醇转化代谢途径及组分，确定对应的关键酶是否调控植物甾醇代谢途径。

魏巍［27］等对利用NI＋亲和层析柱分别得到产物3-甾酮-△1-脱氢酶，3-Ketosteroid-9α-羟化酶还原酶。分别通过对野生菌型及KSdD基因敲除菌进行植物甾醇转化进行实验，采用基于高分辨质谱平台的非靶向代谢组学方法得到野生菌主要积累ADD而KSdD基因敲除菌主要积累AD，证实KSdD是AD到ADD转化的主要酶。

姚抗［28］等通过敲除同工酶的编码基因，构建六株不同的工业分枝杆菌，分析目标基因在不同底物诱导时的转录差异，利用代谢组学证实这些酶在分枝杆菌中的甾醇代谢功能。通过出发菌株M．neoaurum ATCC 257795的基因组信息分析，鉴定出编码Kstd的基因，构建9-OHAD高效生产菌株转化植物甾醇，运用GC-MS技术分析MN-Kstd敲除菌中生成的未知代谢产物，得出3-甾酮-△1-脱氢酶（Kstds）是催化9-OHAD转化为不稳定中间体9-OHADD反应的关键酶。运用TLC、HPLC及LC／MS技术对MN-kshA敲除菌代谢产物分析得到MN-KshA1为KSH的关键加氧酶，对9α-羟基化过程起着无可替代的意义。

徐玲霞［29］等基于分枝杆菌M．neoaurum MN2和MN4全基因信息测序进行甾醇降解关键基因簇分析，通过HPLC技术分析MN2和MN4植物甾醇转化产物得到代谢基因突变导致突变株MN2能够耐受高底物的植物甾醇使得其AD与ADD的比例为13∶1，MN4中转成AD与ADD的比例为20∶1。

WANG［30］等基于分枝杆菌Mycobacterium neoaurum sp HGMS2基因组的分析，鉴定出转化植物甾醇关键基因，利用TLC技术验证KshD基因表达的产物酶的活性；HPLC技术分析得到9α-羟基化酶基因编码的蛋白KsnA395、KsnB122有活性，KsnA266无活性。

5 展望

分枝杆菌对甾醇体的代谢有很好的生物转化功能，近几年对分枝杆菌不同菌株进行基因组测序，深度挖掘测序数据去发现其代谢通路关键酶基因，探索其关键基因功能。推测关键酶在分枝杆菌的代谢途径的分解机制，通过分析其代谢组学，提高甾体药物中间体的产量。分枝杆菌甾醇降解分子机制的相关研究远远还不够，还需要对分枝杆菌降解甾醇的分子生物学机制进行深入的研究。相信随着微生物代谢甾体的机制及其功能簇基因不断被揭示，微生物转化法在甾体药物的生产中将发挥越来越重要的作用。